蜂胶对金黄色葡萄球菌毒力因子的抑制作用

陈志宝,姜游帅,夏礼杰,于 录,邱家章,宋科技,卜仕金,邓旭明

(1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,黑龙江大庆163319;2.扬州大学兽医学院,江苏扬州225009;3.吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春130062)

金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)是临床非常重要的致病菌之一,是引起奶牛和山羊乳房炎最重要的病原菌。目前,全世界有三分之一的奶牛患有奶牛乳腺炎,每年因乳腺炎造成的损失高达350亿美元[1]。研究表明,在临床分离的金葡菌中,超过60%为耐药菌,耐甲氧西林金葡菌(MRSA)感染有明显增高趋势[2]。耐万古霉素金葡菌(VRSA)[3]的出现,使临床中MRSA感染面临无药可治的局面。因此急需寻找新的抗金葡菌药物。

蜂胶是蜜蜂采集植物的芽苞分泌物或伤口处流出的树叶油脂、黏液、树脂、橡胶,并混入蜂蜡和其他分泌物经咀嚼加工而成的一种粘稠物质[4]。蜂胶的成分相当复杂,含有黄酮类、芳香酸、醋类、萜烯类等多种化合物。蜂胶生物活性主要有：抗病毒、抗菌、抗真菌、抗肿瘤、抗氧化、免疫增强作用。蜂胶的抗金葡菌感染机制尚不明确,本文主要探讨亚抑菌浓度蜂胶对金葡菌一些毒力因子分泌的影响。

1 材料与方法

1.1 菌株 标准菌株ATCC29213购自中国药品生物制品检定所(CMCC)。

1.2 试剂和仪器 蜂胶购自CMCC;SuperECL Plus超敏发光液(北京普利莱基因技术有限公司);SEA、SEB抗体(Sigma);UV-2600型紫外可见分光光度计(尤尼柯公司),酶标仪(TECAN)。

1.3 方法

1.3.1 最小抑菌浓度(MIC)以及生长曲线的测定 参照CLSI(Clinical And Laboratory Standards Institute)的标准方法M7-A8,倍比稀释测定蜂胶对ATCC29213的MIC。绘制ATCC29213在不同浓度蜂胶作用的生长曲线。挑取单菌落至3mLLB液体,37℃过夜培养,次日接种至300mLLB液体培养基培养,至OD600nm为0.3时分装成6份,分别加入蜂胶至终浓度为：256μg/mL,128μg/mL,64μg/mL,32μg/mL,16μg/mL,0μg/mL。LB培养基调零,测量OD600nm吸光值,绘制生长曲线。

1.3.2 样品处理 不同药物浓度培养的金葡菌在对数生长后期且相同的OD值(OD600nm=2.5)时取样,12000r/min离心2min,上清用0.22μm滤膜过滤,留作以下试验。

1.3.3 α-溶血素活力测定 参照Bernheimer[5]的方法,无菌条件取去纤维蛋白的新鲜兔血2mL,氯化钙缓冲液(20mmol/LCaCl2,0.125mol/LNaCl)洗涤,3000r/min离心5min,洗涤3次。向1.5 mL灭菌离心管加入875μL氯化钙缓冲液,100μL样品上清,25μL红细胞,37℃孵育30min;5500r/min离心1min;OD543nm测定其吸光值。

1.3.4 凝固酶的效价测定 参考HirokoKuroda等[6]的方法取肝素抗凝的新鲜兔血浆,3000r/min离心10min,按PBS和血浆体积比例 4∶1稀释;用LB培养基将上述收集的菌液倍比稀释,每试管中加100μL;再加0.5mL稀释兔血浆,37℃孵育直至产生凝集。以产生凝集的最高稀释倍数作为凝固酶效价。

1.3.5 肠毒素分析 取上清样品20μL加上样缓冲液,煮沸5min,配制5%浓缩胶,12%分离胶进行SDS-PAGE电泳,半干法转膜(0.03A,30min);3.5%BSA封闭2h;加入一抗(SEA,1∶5000;SEB,1∶1000)室温慢摇1h;TBST清洗3次,每次10min;加入HRP标记的二抗(1∶4000)室温轻摇1h,再洗涤;ECL显色,曝光、显影。

2 结果

2.1 MIC值及抑菌曲线 结果显示蜂胶对金葡菌ATCC29213的MIC为512μg/mL。蜂胶的抑菌作用具有浓度依赖性,1/2MIC时可明显抑制ATCC29213的生长,随着培养时间加长细菌仍可增长,1/4MIC仍有较强的抑菌作用,但比1/2MIC抑菌能力弱,1/8MIC,1/16MIC,1/32MIC浓度蜂胶的抑菌作用不明显(图1)。

图1 生长曲线

2.1 α-溶血素活力测定 结果表明1/2MIC、1/4 MIC、1/8MIC组的溶血活力仅为对照的5.69%、14.78%和13.19%。1/32MIC组溶血活力仍低于对照。高浓度蜂胶对ATCC29213α-溶血素的表达有明显的抑制作用,且在较宽浓度范围都能明显降低 α-溶血素的分泌,低浓度仍能抑制 α-溶血素分泌。

图2 溶血活性分析

2.2 凝固酶分析 试验结果表明,只有256μg/mL组能够降低凝固酶的效价,低浓度时无影响。

2.3 肠毒素分析 Western-blot结果显示,不同浓度蜂胶作用后能够减少肠毒素A、B的产量(图3)。高浓度蜂胶对肠毒素A、B分泌的抑制作用强于低浓度。高浓度的蜂胶对肠毒素B表达的影响要强于肠毒素A。

图3 肠毒素 A、B Western-blot分析

3 讨论

奶牛乳腺炎大部分是由细菌感染引起的,其中最主要的是金葡菌,其造成的乳房内感染占到50%以上[7]。金葡菌感染主要是耐药菌株,其侵入乳腺后被炎症组织包围,使抗菌药物不易到达感染部位[8],并且金葡菌呈高度的接触性传染,很容易在挤奶过程传染。

金葡菌感染产生多种致病相关的毒力因子,破坏宿主的组织器官,特别是α-溶血素,能引起强烈的组织损伤,破坏宿主的免疫系统[9-11],所以在选用抗菌药物时除了考查其抑菌和杀菌能力,还应考察其对毒力因子的影响。很多抗生素能改变金葡菌毒力因子表达,例如,一些β-内酰胺类和氟喹诺酮类抗生素能够刺激α-溶血素表达并增加α-溶血素的分泌,克林霉素几乎能完全抑制α-溶血素的表达[12]。如果能在抑制细菌生长的同时也能够抑制其毒力因子的表达,可降低金葡菌致病力,对治疗金葡菌感染具有重要意义。一些中药单体,如表儿茶酸没食子酸酯也能够降低金葡菌毒力相关蛋白的分泌,表儿茶酸没食子酸酯与β-内酰胺类抗生素合用治疗金葡菌感染将是非常有效的[13]。Smith P等[14]也报道亚抑菌浓度的多种植物挥发油具有抑制金葡菌溶血素、肠毒素等毒力因子产生的作用。

研究表明,蜂胶能够抑制标准菌株ATCC 29213的生长,在低浓度时抑菌作用较弱,虽然亚抑菌浓度的蜂胶不能完全抑制金葡菌生长,但却能够抑制金葡菌的多种毒力因子的分泌。蜂胶对α-溶血素的分泌抑制作用最强,且在较宽浓度范围都能明显降低α-溶血素的分泌。图2表明,1/8 MIC组的溶血活力仅为对照的13.19%,1/32 MIC组溶血活力仍明显低于对照组。可见低浓度的蜂胶就能够减少α-溶血素的产生,从而减轻金葡菌对机体的侵害;表1显示,凝固酶效价在 MIC、1/2MIC时表现出下降作用,在低浓度时凝固酶效价没有改变;图3表明,在不同浓度蜂胶作用下的金葡菌肠毒素分泌量均明显地降低,而在1/2MIC和1/4MIC蜂胶作用下几乎不产生肠毒素B,可以将蜂胶作为食品或饲料的添加剂和防腐剂,能够很好地减少金葡菌分泌的肠毒素对人类和动物的危害。

[1] Jose A,Aldo C A,Horacio R,et al.Field trials of a vaccine against bovine mastitis.1.evaluation in heifers[J].J Dairy Sci,1997,80：845-853.

[2] 董燕,王仙园,周红,等.中草药对M RSA临床株的抑菌作用[J].护理研究,2008,22(10)：863-865.

[3] Hiramatsu K,Hanaki H,Ino T,et al.Methicillin-resistant Staphy lococcus aureus clinical strain with reduced vancomycin suscep tibility[J].Journal of Antimicrobial Chemotherapy,1997,40：135-146.

[4] Burdock A.Review of the Biological Properties and Toxicity of Bee Propolis(Propolis)[J].Food Chem Toxicol,1998,36：347-363.

[5] Rowe G,Welch R.A ssay s of hemolytic toxins[J].Methods Enzymol,1994,235：657-670.

[6] Hiroko Kuroda,Mak oto Kuroda,Longzhu Cui,et al.Subinhibitory concentrations ofβ-lactaminduce haemolytic activity in Staphy lococcus aureus through the SaeRS two-component system[J].FEMS Microbiol Lett,2007,268：98-105.

[7] 赵艳,张爱荣.奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌黏附素疫苗的研究进展[J].畜牧与饲料科学,2008,3：82-85.

[8] Jeffery L,Sarah A.Activity of Selected Antimicrobial Agents Against Strainsof Staphylococcusaur eus Isolated from Bovine Intramammary Infections that Produceβ-Lactamase[J].J Dairy Sci,1997,80：788-791.

[9] Gordon M.The Hemoly sins of Staphylococcus aureus[J].Bacteriological Reviews,1975,39(4)：317-344.

[10]Michelle C,Lee S,James M,et al.Corneal Virulence of Staphylococcusaureus：Roles of Alpha-Toxin and Protein A in Pathogenesis[J].Infection and Immunity,1994,62(6)：2478-2482.

[11]Richard J,Michelle C,Judy M,et al.Specific Roles of Alpha-Toxin and Beta-Toxin during Staphylococcus aureus Corneal Infection[J].Infection and Immunity,1997,65(5)：1571-1578.

[12]Knut O,Wilma Z,Klaus P,et al.Effects of Subinhibitory Concentrations of Antibiotics on Alpha-Toxin(hla)Gene Expression of Methicillin-Sensitive and Methicillin-Resistant Staphy lococcus aur eus Isolates[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy,1998,42(11)：2817-2823.

[13]Shah S,Stapleton D,Taylor P,et al.The polyphenol(-)-epicatechin gallate disrupts the secretion of virulence-related p roteins by Staphylococcus aureus[J].Lett Appl Microbiol,2008,46：181-185.

[14]Smith P,Stewart J,Fyfe L.Influence of subinhibitory concentrations of plant essential oils on the production of enterotoxins A and B andα-toxin by Staphylococcusaureus[J].Journal of M edical Microbiology,2004,53：1023-1027.