2008～2009年西南地区规模化猪场病原菌耐药性流行情况调查

李金良,李旭廷,聂 建,龚 雪,袁定胜,詹素琼,邹立扣

(1.四川省畜牧科学研究院,四川 成都 610066;2.四川大学生命科学学院,四川 成都 610064)

细菌性疾病一直以来是规模化猪场疾病防控的重点,历年的调查表明,直接或继发细菌感染是临床发病和死亡的主要原因,造成的损失巨大。目前对规模化猪场单一疾病的调查研究较多,对较全面的病原菌检测和耐药性研究较少。为了更全面地掌握西南地区规模化猪场病原菌流行情况和耐药情况,实验室对2008～2009年间西南地区的病样进行了病原菌的分离鉴定、致病性试验和药敏试验,报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 TSA琼脂,TSB肉汤,麦康凯琼脂,S.S.琼脂,MH琼脂,NAD,酵母浸膏购自广州环凯微生物科技有限公司;药敏纸片购自广州迪景微生物科技有限公司,PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;GoldView染料、琼脂糖、DNA Marker 2 000购自成都飞克(天泰)生物科技有限公司。

1.2 仪器 OLYMPUS显微镜,隔水式恒温培养箱,PCR仪(Bio-Rad),DYY-Ⅱ恒压恒流电泳仪(Bio-Rad),Gene凝胶成像仪。

1.3 细菌分离纯化 病料样本来源为刚死亡病猪、濒死猪和已解剖取样后的脏器组织,取样部位为心、心包积液、胸腔积液、肺、肝、脾、肾、淋巴结、胆囊、十二指肠等。用无菌棉拭子蘸取组织液,接TSA血平板、巧克力琼脂(含NAD和酵母浸膏)、麦康凯和S.S.琼脂,37℃培养,菌落生长后着重选优势菌落,进行1～2次划线纯化细菌。

1.4 细菌鉴定

1.4.1 菌落形态特征观察 对大小、形状、颜色、光滑粗糙与否、扩散与否,溶血与否等基本性状进行区分,并单独划线纯化,革兰染色后显微镜观察。

1.4.2 16S rDNA序列分析 试验采取菌落PCR法扩增细菌16S rDNA基因,引物为16SrDNA通用引物 27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)、1492R(5′-TACGGHTACCTTACGACTT-3′)。反应条件：95℃5 min;95℃1 min,50℃1 min,72℃1.5 min,30次循环;72℃延伸 5 min;4℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。获取1 400 bp左右的目标片段后,PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司纯化并测序,利用BLAST搜索软件将菌株16S rDNA序列结果与GenBank数据库比对后鉴定细菌。

1.5 致病性试验 将纯化菌落用生理盐水稀释至5.0×108CFU/mL,0.5 mL腹腔注射小鼠,观察3 d,剖检死亡小鼠,取心血、肝脏划线培养,革兰染色观察,并与初始培养细菌信息对照,确定菌株致病性。

1.6 药敏试验 试验重点选取致病菌株和具有地方代表性的典型菌株进行药敏试验,按照CLSI推荐的K-B法进行。根据NCCLS(2006)的标准判定其耐药性。

2 结果与分析

2.1 细菌检验和致病性结果 本实验室在2008年到2009年间对西南地区47个大、中、小型规模化猪场364份病样进行细菌分离,307份病样检出病原菌,分离率达84.3%,其中115份病样检测出1种以上细菌,混合感染率为37.4%。试验共分到病原菌509株,病原菌检出分布和致病性试验结果见表1。

表1 病原菌检出分布和致病性试验结果

检出病原菌主要有大肠杆菌、葡萄球菌、肠球菌、肺炎克雷伯菌、变形杆菌、链球菌(表1)。其中革兰阴性菌中有134株有致病性;革兰阳性菌有56株有致病性,革兰阴性菌(46.8%)的致病率明显高于革兰阳性菌(25.1%)。

大肠杆菌多分离自心、脾脏、肾脏和淋巴结,占30.4%,小鼠致死率高达 56.4%。葡萄球菌占21.6%,主要有猪葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、产色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、表皮葡萄球菌,致死率较低(19%)。链球菌主要为猪链球菌和猪肺炎链球菌(5.9%),致死率高达66.6%。肠球菌有粪肠球菌和屎肠球菌,占11.4%,致死率低(10.3%)。肺炎克雷伯菌(8.7%)检出率和致死率(31.8%)都较高。变形杆菌主要是奇异变形杆菌(8.5%),致死率16.2%。志贺氏菌、沙门菌、巴氏杆菌、嗜血杆菌、放线杆菌检出率较低(＜4%),但致死率较高(＞36%)。其他检出细菌占2.3%,有柠檬酸细菌、罗斯氏菌、产酸克雷菌、洛菲不动杆菌、恶臭假单胞菌、产气单胞菌、绿浅气球菌,致死率高(41.6%)。

2.2 菌株耐药性研究结果 本研究选取了191株致病菌株为主的病原菌,进行了7类共17种药物的药敏试验,结果如下。

2.2.1 病原细菌耐药率结果与分析 见表2。

表2 病原菌耐药率

根据耐药率的结果发现,整体上,不同种属的细菌的耐药情况有少数差异,但基本一致,革兰阴性菌以大肠杆菌为代表,革兰阳性菌以葡萄球菌为代表。

按药物不同比较,复合β-内酰胺酶抑制剂类药物(AMC,SAM,TIM)和头孢噻呋(EFT)的整体耐药率都较低(≤18.8%),其他13种药物耐药性高,其中氨苄西林(AMP),阿莫西林(AML),替卡西林(TIC),红霉素(E),克林霉素(DA),林可霉素(MY),土霉素(OT)的耐药最为严重(革兰阴性菌70.5%～96.4%,革兰阳性菌42.4%～92.4%)。

革兰阴性的3类细菌(大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、变形杆菌)耐药情况相当;不同点：大肠杆菌对头孢类药物(EFT,KF,CL)耐药率明显高于其他两类革兰阴性菌;变形杆菌对庆大霉素(CN)、诺氟沙星(NOR)、环丙沙星(CIP)的耐药率(83.3%)高于其他两种革兰阴性菌(≤69.2%),但对丁胺卡那霉素(KAN)、头孢类药物(EFT,KF,CL)较敏感(16.6%)。

革兰阳性的3类细菌(葡萄球菌、链球菌、肠球菌)相比较,耐药情况基本一致;不同点：肠球菌对头孢噻吩(KF)的耐药率(15.7%)明显低于其他两类革兰阳性菌(≥40.8%),对林可霉素(MY)的耐药率高达100%;葡萄球菌对丁胺卡那霉素(KAN)的耐药率(30.6%)低于其他两类革兰阳性菌(≥52.6%)。

2.2.2 菌株耐药的多重性分析 见表3。

菌株多重耐药性以 4重、5重、6重耐药(16.2%,26.1%,28.8%)为主,3重和 7重耐药(9.9%)其次,只耐一类药和2重耐药的菌株很少(2%,5.7%)。

研究表明,7类抗生素都存在耐药菌株分布数目随“多重指数”增加而增加的现象,但由于菌株对复合β-内酰胺酶抑制剂类药物较敏感,造成7重的耐药菌株数较少,而不是随趋势攀升。

菌株在这7类抗生素上的构成比反映了对7类抗生素的总耐药率,和表2中单药的耐药率比较发现：复合 β-内酰胺酶抑制剂类药物总耐药率(23.5%)远高于(2倍以上)对应3种(AMC,SAM,TIM)中任意一个的耐药率(9.4%～11.3%),说明菌株对该类的3种药物的“耐药谱离散度”较大,同时耐2种和3种复合β-内酰胺酶抑制剂类药物的细菌很少。其他6类抗生素总耐药率略高于单药的耐药率,但差值不大,说明菌株对同类药物之间交叉耐药的情况居多。

表4 菌株对7类抗生素的多重耐药结果表

3 讨论

3.1 病原菌流行特点 本实验室在2008～2009年间临床研究发现,西南地区规模化猪场(患猪)细菌检出率很高(84.3%),病原菌的分布与豫北地区和浙江地区的类似报道有所不同,与上海地区2007年报道相当[1-3],其中大肠杆菌、链球菌检出率基本一致,大肠杆菌仍然是规模化猪场主要检出病原,并且致病性在其他报道中也很高(＞70%)[4-6],所以控制大肠杆菌病仍然是猪场疾病防控的重点。肺炎克雷伯氏菌、肠球菌、葡萄球菌、变形杆菌检出率都比其他报道高,特别是肺炎克雷伯氏菌、肠球菌在猪场的研究中少有报道,而人医上研究报道较多[7],值得关注。

3.2 耐药性流行情况 耐药性的研究显示,头孢类药物和兽医上应用相对较少的复合β-内酰胺酶抑制剂类药物的耐药率低,而以前广泛使用的药物耐药率都很高,与其他地区猪场和人医报道情况相当[8-9]。本次结果与四川大学田国宝(2003～2005)和汤景元(2006～2007)研究结果相比发生变化,一致的是西南地区病原菌对头孢类耐药性较低,青霉素类、大环内酯类和四环素类耐药率仍然非常高,不同的是以往报道有一定敏感性的氨基糖苷类药物(CN、KAN)耐药率已经逐渐升高(2005年10%左右到目前 45%左右),氟奎诺酮类药物(NOR、CIP)耐药率从 2003年的 38.9%上升到目前60%左右[10-11],上升趋势令人担忧;病原菌多重耐药以5重、6重耐药为普遍趋势,这与目前猪场用药不合理,不规范和饲料添加抗生素等滥用情况有关。本研究还将对耐药基因的流行情况进一步研究。

3.3 规模化猪场细菌性疾病探讨 细菌疾病的发生不是偶然的,原因很多,但主要有两点需要重视：第一,病毒性疾病的流行得不到有效控制,特别是猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒对猪免疫系统的破坏加大了细菌感染几率和造成病发死亡率升高。第二,猪场管理和生产细节存在漏洞,给细菌很大的传播和繁殖的空间,加大发病的可能,特别是滥用抗菌药物导致正常菌群失衡诱发条件致病菌发病等情况需要引起高度重视。在对疾病治疗前应做好检测,针对性用药。杜绝盲目用药造成耐药性加剧,最后导致无药可用的局面,对疾病的防控理念应在优化日常管理和加强卫生消毒中,减少日常投药。

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