多种药物对急性羰基镍中毒大鼠肺组织和细胞损伤的治疗作用

刘 静，王秋英，陈 琼，吴喜江，闫铭锋，宣小强，程 宁，4

(1.兰州大学基础医学院医学实验中心，甘肃兰州 730000;2.金川集团有限公司职工医院，甘肃金昌 737103;3.兰州大学公共卫生学院流行病与卫生统计学研究所，甘肃兰州730000;4.甘肃省新药临床前研究重点实验室，甘肃兰州 730000)

羰基镍是化学冶金工业生产中的剧毒化合物之一［1］。急性肺损伤是羰基镍中毒的最突出表现［2］，肺泡上皮细胞和肺毛细血管内皮细胞是主要受损靶点。近年来对急性羰基镍中毒主要采用激素、驱镍和对症治疗，甲泼尼龙可减轻肺泡上皮及毛细血管内皮细胞损伤，减少渗出、降低毛细血管通透性和减轻炎症反应;扎西他滨，化学名二乙基二硫代氨基甲酸钠(sodium diethyl dithiocarbamate，DDC)是研究较多的急性羰基镍中毒解毒剂;研究表明，亚硒酸钠分解的Se与进入到生物体的重金属产生拮抗作用［3］;中药也是目前探讨的问题。本研究选取了甲泼尼龙、DDC、亚硒酸钠和中药参附回阳汤4种药物，通过单细胞凝胶电泳实验(single cell gel electrophoresis，SCGE)、组织病理学以及细胞超微结构观察，评价对大鼠急性羰基镍中毒肺组织和细胞损伤修复情况。

1 材料与方法

1.1 药物和仪器

甲泼尼龙，辉瑞制药比利时分公司，进口药品注册证号:H20060054;DDC，天津市化学试剂研究所，批号:20010819;亚硒酸钠，天津市德恩化学试剂有限公司，批号:20071020;参附回阳汤包括组分:参附注射液，四川雅安三九药业有限公司，批号:080815;丹参注射液，四川三精升和制药有限公司，批号:081109;甘草注射液，日本米诺发源制药株式会社，批号:01877。IX71-A12FL/PH型荧光显微镜和 H42604例置显微镜，日本 Olympus公司;IFM-1230型透视电子显微镜，日本JEOL公司。

1.2 动物分组与给药

SPF级SD大鼠220只，体重180～200 g，购于西安交大基础医学部实验动物中心，动物许可证号:SCXK(陕)2007-001。动物共分为7组，正常对照组和染毒对照组各10只，其余为甲泼尼龙20 mg·kg－1，DDC 100 mg·kg－1，亚硒酸钠10 μmol·kg－1，参附回阳汤 0.25 ml，甲泼尼龙 20 mg·kg－1+DDC 100 mg·kg－1组，每组40只。除正常对照组其余各组大鼠静态吸入羰基镍250 mg·m－3染毒30 min，分别于染毒后4和30 h ip给药，给药后3 d和7 d取材，每小组各10只大鼠。

1.3 单细胞凝胶电泳实验检测肺细胞DNA损伤

取大鼠肺组织约0.2 g，匀浆，过滤，收集细胞悬液，预冷PBS液情况和稀释，4℃保存备用。SCGE检测方法见文献［4］，胶体调整为底胶层、细胞层低熔点胶层、低熔点胶层。选择515～560 nm波长激发光照射样本，荧光显微镜观察每个样本，随机选择25个细胞拍摄，每组共计100个细胞，用CASP彗星分析软件分别测量所选细胞的彗星尾长(tail length，TL)、olive 尾矩(olive tail moment，OTM)等指标。

1.4 大鼠肺组织病理变化观察

将大鼠肺组织5 mm×5 mm，10%甲醛固定，脱水，常规石蜡包埋，间隔连续切片，厚5～8μm，HE染色，光镜观察病理组织学变化。

1.5 细胞超微结构观察

取大鼠肺组织2 mm×2 mm×2 mm，2.5%戊二醛固定，脱水，橡胶包埋，透视电镜超薄切片，JEM-1230透射电镜观察。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 多种药物对羰基镍中毒大鼠细胞DNA的影响

2.1.1 多种药物对羰基镍中毒大鼠细胞“彗星”尾长的影响

表1结果为给药后3 d的取材结果。与正常对照组比较，甲泼尼龙4和30 h组，DDC 4 h组及甲泼尼龙+DDC 4 h组尾长无明显差异，与染毒对照组比较，甲泼尼龙、DDC、亚硒酸钠、参附回阳汤及甲泼尼龙+DDC组彗星尾长明显缩短(P＜0.05);提示甲泼尼龙4和30 h组，DDC 4 h组及甲泼尼龙+DDC 4 h组DNA损伤已恢复到和正常水平接近，治疗作用优于其他药物组。甲泼尼龙及甲泼尼龙+DDC 4 h给药尾长显著小于30 h给药组(P＜0.05)，提示4 h给予甲泼尼龙及甲泼尼龙+DDC疗效优于30 h给药。

表2结果为给药后7 d的取材结果。与染毒对照组比较，甲泼尼龙组、DDC(4 h给药)及甲泼尼龙+DDC组大鼠染毒后4 h和30 h给药7 d的“彗星”尾长显著缩短(P＜0.05)，提示这些药物对急性羰基镍中毒后大鼠肺细胞DNA损伤修复均有一定作用(P＜0.05);与正常对照组比较，除甲泼尼龙4 h和30 h组及DDC 4 h组外，其余各组尾长显著增加(P＜0.05)，提示其中甲泼尼龙 4 h、30 h组和DDC 4 h取材组DNA损伤已恢复到接近正常水平，治疗作用优于其他组。其中同为7 d取材甲泼尼龙组和参附回阳汤组4 h给药尾长明显小于30 h(P＜0.05)，提示染毒后4 h给予甲泼尼龙和参附回阳汤疗效果优于染毒后30 h给药。

表1 大鼠染毒4 h和30 h后给药3 d的彗星尾长Tab.1 The comet tail length at 4 and 30 h delivery after 3 d in rats exposed

表2 大鼠染毒后4 h和30 h给药7 d的彗星尾长Tab.2 The comet tail lenght at 4 and 30 h delivery after 7 d in rats exposed

2.1.2 多种药物不同时间给药对羰基镍中毒大鼠细胞“彗星”olive尾矩的影响

表3结果显示，与染毒对照组尾矩比较，甲泼尼龙、DDC、亚硒酸钠、参附回阳汤及甲泼尼龙+DDC在统计学上均有显著性差异(P＜0.05)，提示这些药物对急性羰基镍中毒后大鼠肺细胞DNA损伤修复均有一定作用;与正常组尾矩比较，甲泼尼龙、DDC、亚硒酸钠 30 h给药差异无统计学意义(P＞0.05)，提示甲泼尼龙、DDC、亚硒酸钠使 DNA损伤已恢复正常水平水平。甲泼尼龙、参附回阳汤和甲泼尼龙 +DDC4 h给药尾矩小于30 h(P＜0.05)，提示4 h给予甲泼尼龙、参附回阳汤和甲泼尼龙+DDC疗效果优于30 h给药。

表3 大鼠染毒后4 h和30 h给药3 d观察的“彗星”olive尾矩Tab.3 The comet olive tail moment at 4 and 30 h delivery after 3 d in rats exposed

表4结果显示，与染毒对照组比较，甲泼尼龙及甲泼尼龙+DDC治疗后的尾矩差异有统计学意义(P＜0.05)，提示这两组药物对急性羰基镍中毒后大鼠肺细胞DNA损伤修复均有一定作用;与正常组比较，DDC组和亚硒酸钠组尾长在统计学上有明显差异(P＜0.05)，提示甲泼尼龙和甲泼尼龙 +DDC组治疗后DNA损伤已恢复到正常水平，疗效优于其余给药组。甲泼尼龙4 h给药olive尾矩小于30 h(P＜0.05)，提示4 h给予甲泼尼龙疗效果优于30 h给药。

图1所示急性羰基镍中毒大鼠分别在4 h和30 h给药后3 d和7 d取材观察肺细胞DNA损伤修复“彗星”图，可见甲泼尼龙和甲泼尼龙+DDC组“彗星”拖尾不明显，基本接近正常组，DDC、亚硒酸钠及参附回阳汤组“彗星”拖尾明显。

表4 大鼠染毒后4 h和30 h给药7 d观察的“彗星”Olive尾矩Tab.4 The comet olive tail moment at 4 and 30 h delivery after 7 d in rats exposed

2.2 药物对羰基镍中毒大鼠肺组织病理改变的影响

组织病理学观察发现，羰基镍250 mg·m－3染毒对照组主要以急性渗出性改变为主，伴有轻微增生性改变，表现为肺泡内中度水肿，少量红细胞及纤维素沉积，肺泡Ⅱ型上皮增生，肺泡间隔增宽并有融合性改变，部分肺泡腔内有泡沫样细胞及透明膜样物(图2A)。甲泼尼龙组肺急性损伤明显减轻，轻度肺水肿，间隔增宽范围减少，炎性反应较轻(图2B)。DDC组轻度气肿或气肿不明显，小支气管、细支气管腔内少量炎性渗出，间质部分增宽，气管间质少量散在或小灶状炎细胞浸润(图2C);甲泼尼龙+DDC组:肺改变好于单用甲泼尼龙和DDC组，炎性反应轻，仅呈气管急性黏膜炎表现(图2D)。

2.3 药物对羰基镍中毒大鼠肺细胞超微结构的影响

超微结构观察如图3所示，与染毒对照组比较甲泼尼龙4 h给药组大部分肺泡结构正常，肺泡Ⅱ型细胞核形态正常，胞质内见较多板层体结构，肺泡间质胶原纤维明显减少，线粒体无肿胀出现(图3B);甲泼尼龙30 h给药组大部分肺泡结构正常，肺泡壁未见增厚，大部分肺泡Ⅱ型细胞结构正常，少部分肺泡Ⅱ型细胞胞质内线粒体轻度肿胀，板层体减少，空泡增多，局部肺泡腔见脱落的细胞碎屑(图3E)，提示甲泼尼龙4 h给药疗效优于30 h给药;DDC 4 h给药组大部分肺泡结构正常，肺泡腔脱落的细胞碎屑也有所减少，但部分肺泡Ⅱ型细胞胞质内仍可见到线粒体肿胀，线粒体脊减少或溶解等情况(图3C);甲泼尼龙+DDC 4 h给药组为基本正常肺泡Ⅱ型细胞结构(图3D);甲泼尼龙+DDC 30 h给药组肺泡结构、肺泡腔、肺泡Ⅱ型细胞、肺泡壁及肺泡间质基本恢复到正常水平(图3F)。

图1 大鼠羰基镍染毒后不同时间给药和取材肺细胞DNA“彗星”图像.动物分组处理见表1.图中1和2为4 h给药3 d和7 d取材;3和4为30 h给药3 d和7 d取材;A－B:正常对照组分别为3 d和7 d取材;C－D:染毒对照组分别3 d和7 d取材;E:甲泼尼龙;F:DDC;G:亚硒酸钠;H:参附回阳汤;I:甲泼尼龙+DDC.Fig.1 DNA comet image of lung cells in rats exposed in carbonyl nickel were given different drugs at different times.

图2 大鼠染毒后4 h给药3 d取材肺组织病理改变 (×100).动物分组及处理见表1.A:染毒对照组;B:甲泼尼龙;C:DDC;D:甲泼尼龙+DDC.Fig.2 Pathological changes in lung tissues in rats exposed in carbonyl nickel were given drugs at 4 h after exposure and sacrificed after 3 d.

图3 大鼠羰基镍染毒后4 h给药3 d取材肺组织超微结构表现(×6000).动物分组及处理见表1.A:染毒对照;B:甲泼尼龙4 h给药;C:DDC 4 h给药;D:甲泼尼龙+DDC 4 h给药;E:甲泼尼龙30 h给药;F:甲泼尼龙+DDC 30 h给药.Fig.3 Ultrastructure of lung cells in rats exposed in carbonyl nickel were given drugs at 4 h after exposure and sacrificed after 3 d.

3 讨论

急性羰基镍中毒相关治疗药物的效果有待评估，影响了急性羰基镍中毒的临床治疗。目前国内外学者认为糖皮质激素可减轻肺的渗出性损害，防止或减轻急性呼吸窘迫综合征(ARDS)以及多脏器功能障碍综合征，如Meduri等［5］研究显示，适量、短疗程的运用甲泼尼龙对ARDS造成的肺损伤有治疗作用，且可降低多脏器功能障碍综合征发病率和患者死亡率。有研究显示大鼠羰基镍吸入染毒15 min后立即口服双硫仑(戒酒硫)或DDC，结果DDC效果明显好于双硫仑［6］。Sunderman 等［7］用 DDC 治疗50例尿镍为100～2470 mg·L－1的中毒患者，疗效均明显，并于3周后恢复工作。Seet等［8］曾报道螯合剂DDC与双硫仑用于治疗羰基镍中毒，虽然动物实验中结果良好，但因羰基镍中毒病例稀少和中毒后不能及时诊断等限制，其作用尚待进一步证实。我们选取甲泼尼龙、DDC、亚硒酸钠和参附回阳汤四类药物，通过染毒后不同时间给药，筛选和评估疗效最佳药物及最佳给药时间。SCGE、组织病理学及电镜结果均提示甲泼尼龙和甲泼尼龙+DDC两组药物治疗效果明显，这一结果与临床急性羰基镍中毒病例使用甲泼尼龙后症状缓解较快相符，但甲泼尼龙联合DDC使用后，效果不如单用甲泼尼龙明显，可能与DDC药物加重某些脏器损伤有关［6］。

肺心病患者使用参附注射液进行治疗，患者临床疗效、血气和肺功能指标等优于未使用该药的患者，表明常规治疗基础上加参附注射液对肺心病急性发作期的治疗具有较好的临床价值［9］。本研究在参附注射液基础上加入丹参、甘草配制成参附回阳汤，观察其对急性羰基镍中毒大鼠肺细胞DNA损伤的修复情况。结果发现使用参附回阳汤后肺的充血反而加重，考虑与丹参活血化瘀功效和多活性成分之间存在协同、拮抗作用作用方式有关。

本研究结果提示，急性羰基镍中毒早期使用药物干预效果较好，为临床治疗提供了参考依据。DDC等特效解毒药物的疗效尚需继续研究。

志谢:感谢金川公司镍钴工业卫生研究所黄克英、毛晓丽、任秀芳、祁光伟、徐东伟和邱菊花在动物饲养等方面帮助，感谢兰州大学闫铭锋、张小培、罗琴和李宇在样本取材处理上的帮助!

［1］Barceloux DG.Nickel［J］.Toxicol Clin Toxicol，1999，37(2):239-258.

［2］Barnes JM，Denz FA.The effect of 2，3-dimercapto-propanol(BAL)on experimental nickel carbonyl poisoning［J］.Br J Ind Med，1951，8(3):117-126.

［3］Mahboob M，Shireen KF，Atkinson A，Khan AT.Lipid peroxidation and antioxidant enzyme activity in different organs of mice exposed to low level of mercury［J］.J Environ Sci Health B，2001，36(5):687-697.

［4］Gutiérrez S，Carbonell E，GalofréP，Creus A，Marcos R.Application of the single cell gel electrophoresis(SCGE)assay to the detection of DNA damage induced by131I treatment in hyperthyroidism patients［J］.Mutagenesis，1998，13(1):95-98.

［5］Meduri GU，Headley AS，Golden E，Carson SJ，Umberger RA，Kelso T，et al.Effect of prolonged methylprednisolone therapy in unresolving acute respiratory distress syndrome:a randomized controlled trial［J］.JAMA，1998，280(2):159-165.

［6］Baselt RC，Hanson VW.Efficacy of orally-administered chelating agents for nickel carbonyl toxicity in rats［J］.Res Commun Chem Pathol Pharmacol，1982，38(1):113-124.

［7］Sunderman FW Sr.Use of sodium diethyldithiocarbamate in the treatment of nickel carbonyl poisoning［J］.Ann Clin Lab Sci，1990，20(1):12-21.

［8］Seet RC，Johan A，Teo CE，Gan SL，Lee KH.Inhalational nickel carbonyl poisoning in waste processing workers［J］.Chest，2005，128(1):424-429.

［9］李翔敏，翟同钧.参附注射液对老年肺心病急性发作期心肺功能的影响［J］.重庆医学，2006，35(13):1219-1221.