自然发酵风干肠中乳酸菌的分离与鉴定

赵俊仁，孔保华

（1.黄冈师范学院生命科学与工程学院，湖北黄冈438000；2.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030）

自然发酵风干肠中乳酸菌的分离与鉴定

赵俊仁1，2，孔保华2，*

（1.黄冈师范学院生命科学与工程学院，湖北黄冈438000；2.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030）

以自然发酵风干肠为研究对象，分析了细菌总数和乳酸菌菌数的变化情况，结果表明，乳酸菌为风干肠发酵过程中的优势菌群。通过对风干肠中乳酸菌的分离鉴定，共分离出戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp lactis）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）和发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）5株乳酸菌。24h产酸速率测定结果表明，弯曲乳杆菌＞短乳杆菌＞乳酸乳球菌乳酸亚种＞戊糖片球菌＞发酵乳杆菌。

发酵风干肠，乳酸菌，分离，鉴定

风干肠是我国北方地区具有传统特色的发酵肉制品，其特点是水分含量低、贮存期长、赋有特殊质地和风味，深受广大群众的喜爱。自然发酵风干肠内部的微生物包括原料中固有的和环境中后污染的菌群，乳酸菌是发酵肉制品在自然发酵过程中最易生长的微生物区系。有研究表明乳酸菌能促使亚硝酸盐分解，减少产品中残留的亚硝胺［1-2］；同时抑制大肠杆菌、沙门氏菌等致病菌的生长［3-4］。乳酸菌对人体的主要作用是调整肠道环境，即乳酸菌将乳糖分解为乳酸，使肠道形成酸性环境；同时具有赋予产品优良感官性，丰富的营养性和提供安全性的优点。国外早在上世纪20年代就使用乳酸菌进行发酵肉制品的生产。Rantsiou等人从三种欧式发酵香肠中分离出弯曲乳杆菌、植物乳杆菌和清酒乳杆菌［5］。有研究者从意大利发酵香肠中分离出465株乳酸菌［6］。Greco等人从传统欧式干发酵香肠中分离出112株乳酸菌［7］。本研究旨在通过对自然发酵风干肠内部乳酸菌的分离鉴定，获得快速产酸的菌株，为肉用复合发酵剂的制备提供优良的微生物菌株，以达到提高生产速率、稳定生产的目的。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

原料肉 宰后6h的新鲜猪臀肉、里脊肉及背脂（4℃保存），购于北大荒肉业；肠衣 猪小肠衣；白砂糖、食盐、姜、淀粉、调味料等 均由市场购得；微生物生化鉴定管 杭州天和试剂公司；亚硝酸钠，NaCl，乙酸钠，吐温-80，CaCO3，乙醇，甲基红，二甲基氨基苯甲醛，KOH，对氨基苯磺酸等，MRS（Man-Rogosa-Sharpe）培养基，营养琼脂培养基，肉肠模拟培养基，产H2S培养基，产H2O2检测用培养基，硝酸盐还原培养基、产氨培养基、糖发酵培养基、明胶液化培养基、精氨酸水解培养基、胰蛋白胨水培养基等。

XSZ-G型显微镜 OLYMPUS公司；DH5000A电热恒温培养箱 连云港医疗器械设备厂；pHS-25型pH计 上海精科雷磁仪器厂；SW-CJ-1FD超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；TU-1800紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司。

表2 分离乳酸菌的菌体形态特征

1.2 实验方法

1.2.1 风干肠制作 将原料肉（瘦肉与肥肉比例为9∶1）加入食盐和亚硝酸盐后腌制24h，绞碎，肥肉切丁；加入调味料拌馅，灌肠，风干7～10d。

1.2.2 菌数测定 按发酵时间0～10d，每天取样，每份样品5.0g，样品无菌剥去肠衣后剪碎研磨，加入45mL生理盐水中，4℃下平衡20min。采用营养琼脂培养基和MRS固体培养基进行平板涂布，将平衡好的样品梯度稀释，按发酵天数，适当选取2～3个稀释度进行涂布，在35℃下培养48h分别测定总菌数与乳酸菌菌数。

1.2.3 乳酸菌的分离 在MRS固体培养基中，选取溶CaCO3圈较大的几株优势菌株划线分离，直到得到纯菌株。纯化后的菌株分别接种到MRS斜面培养基，置于4℃冰箱中保存备用。

1.2.4 乳酸菌的鉴定

1.2.4.1 形态学鉴定 将分离纯化后的菌株涂布到MRS固体培养基上，35℃下培养24h，观察菌落特征，取典型菌落进行革兰氏染色，并在油镜下观察菌体形态。

1.2.4.2 生理生化实验 对分离后的菌株进行过氧化氢酶实验、产硫化氢实验、葡萄糖产气实验、产粘性实验、硝酸盐还原实验、产吲哚实验、产氨实验、明胶液化实验和精氨酸水解实验；用半固体培养基测定菌株的运动性。

1.2.4.3 耐盐实验与耐亚硝酸盐实验 将分离菌株分别接种到含有 4%和 6%NaCl以及 150mg/kg NaNO2的MRS液体培养基中，于35℃下培养24h，以不接菌的MRS培养基作空白对照，用紫外分光光度计于600nm下，测定OD值，比较生长情况。

1.2.4.4 糖醇发酵实验 通过菌株的糖醇发酵实验，检验分离菌株对各种糖醇类碳源的利用情况。

1.2.5 蛋白酶和脂肪酶活性实验 采用添加15%脱脂乳的MRS固体培养基，分别滴入0.1mL的菌液涂布均匀，35℃培养24h。当牛乳中的酪蛋白被分解后，菌落周围会出现透明环，以此判定菌种有无分解蛋白质的性质。采用添加15%猪油和中性红指示剂的MRS固体培养基，分别滴入0.1mL的菌液涂布均匀，35℃培养24h。当菌种分解脂肪产生脂肪酸时，培养基上会出现红色斑点。

1.2.6 乳酸菌产酸速率的测定 在模拟肉肠培养基中，分别接入分离菌株，在35℃下培养，并测定24h内的pH变化情况。

1.3 统计分析

所得数据为三次测定值的平均值。使用Sigmaplot 9.0（画图软件）作图，使用Statistix8.1（分析软件，St Paul，MN）进行统计分析，并进行多重比较（P＜0.05）。

2 结果与讨论

2.1 自然发酵风干肠中总菌数与乳酸菌菌数的变化情况

自然发酵风干肠内部微生物变化极其复杂，多数研究表明乳酸菌为发酵肉制品中的优势菌群，并在发酵过程中起到降低 pH的作用［8］。图1表明，1～2d内总菌数与乳酸菌菌数显著上升（P＜0.05），由此推断总菌数的升高主要由乳酸菌的大量繁殖所导致。整个发酵过程中乳酸菌始终为风干肠内的优势菌群，控制发酵过程。

图1 自然发酵风干肠中总菌数及乳酸菌菌数的变化情况

2.2 乳酸菌的鉴定结果

通过各鉴定实验，从自然发酵风干肠中共分离筛选得到5株乳酸菌，分别编号为L1、L2、L4、L5和L6，基本情况及发酵特性如下。

2.2.1 乳酸菌的形态学鉴定结果 对分离菌株的菌落的大小、颜色、透明度、致密度、边缘整齐度以及表面光滑程度等指标进行分析。由表1可以看出，自然发酵风干肠中的乳酸菌多数为（灰）白色，菌落表面光滑，边缘整齐，菌落多数不透明。乳酸菌菌体形态见表2与图2，均为革兰氏阳性菌G+；排列方式各不相同，成对、四联、短链或并排链状排列。

表1 分离乳酸菌的菌落形态特征

2.2.2 乳酸菌的生理生化鉴定结果 乳酸菌的生理生化反应与糖发酵实验结果分别见表3和表4。各分离乳酸菌均不具有运动性、不产粘液、不产硫化

图2 分离乳酸菌菌体形态图

表3 乳酸菌的生理生化鉴定结果

表4 乳酸菌糖发酵实验结果

根据菌体和菌落形态、生理生化实验及糖发酵实验结果，对照《伯杰氏细菌鉴定学手册》［9］和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》［10］对菌株进行鉴定分析。鉴定结果为：L1为戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）；L2为乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp lactis）；L4为短乳杆菌（Lactobacillus brevis）；L5为弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）；L6为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）。

2.3 乳酸菌对蛋白质和脂肪降解能力的测定

分离5株乳酸菌对蛋白质和脂肪的降解实验结果见表5。发酵肉制品中的乳酸菌如果具有蛋白质降解活性，则可能降低产品的货架期，引起腐败现象；同样，具有脂肪降解活性的乳酸菌会使产品在储存销售过程中出现酸败味，影响产品质量［11］。由表5可知，各株分离乳酸菌对蛋白质和脂肪均无降解作用，可作为肉用发酵剂使用。

2.4 乳酸菌菌株24h内产酸能力测定

产酸速率是衡量乳酸菌发酵剂品质的重要指标之一。快速产酸可缩短生产周期，并使乳酸菌迅速成为优势菌群，抑制其它有害菌及致病菌的生长，提高产品的生物安全性。由图3可见，5株乳酸菌在前3h的pH均呈快速下降趋势，无显著差异；6h后，各菌株的pH下降表现出差异性（P＜0.05）。其中，L6下降最缓慢，L5和L1下降最快速。前9h为乳酸菌生长的对数生长期，在此期间乳酸菌大量繁殖，导致pH的迅速下降，基本达到5.0以下。9h后，pH呈小幅度下降，乳酸菌生长进入衰退期。可见，24h内，L6的产酸能力最弱，其他四株乳酸菌相对较强。

图3 乳酸菌菌株24h内pH的变化情况

3 结论

自然风干肠发酵过程中乳酸菌为优势菌群，控制发酵过程，对自然发酵风干肠中的乳酸菌进行分离鉴定，得到5株乳酸菌，分别为戊糖片球菌、乳酸乳球菌乳酸亚种、短乳杆菌、弯曲乳杆菌和发酵乳杆菌，其中弯曲乳杆菌产酸最快速。该结果丰富了我国发酵肉制品中优势乳酸菌的种类，为发酵肉制品的工业化生产提供了更多的菌种选择。

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［9］Budanan R E，Gibbonr N E.伯杰氏细菌鉴定手册［M］.中国科学院微生物研究所译，中国科学出版社，1984.

［10］凌代文.乳酸细菌分离鉴定及实验方法［M］.中国轻工业出版，1998：6-27.

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Isolation and identification of lactic acid bacteria from the Chinese-style naturally dry fermented sausages

ZHAO Jun-ren1，2，KONG Bao-hua2，*
（1.College of Life Science and Engineering，Huanggang Normal University，Huanggang 438000，China；2.College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

The Chinese-style naturally dry fermented sausages were used for this study.The changes of the number of total bacteria and lactic acid bacteria during the process were analyzed.The lactic acid bacteria were predominant microorganism.Lactic acid bacteria included 5 species，there were Pediococcus pentosaceus，Lactococcus lactis subsp lactis，Lactobacillus fermentum，Lactobacillus curvatus and Lactobacillus brevis.The acidifying rate were studied，the results showed that Lactobacillus curvatus＞Lactobacillu brevis＞Lactococcus lactis sub lactis＞Pediococcus pentosaceus＞Lactobacillus fermentum.

naturally dry fermented sausages；lactic acid bacteria；isolation；identification

TS201.3

A

1002-0306（2010）11-0158-04

2010-04-19 *通讯联系人

赵俊仁（1980-），女，讲师，博士，研究方向：畜产品加工。

国家公益性行业（农业）科研专项经费项目（200903012-02）；湖北省教育厅科学技术研究计划优秀中青年人才项目（08BQ099）；东北农业大学创新团队发展计划资助（CXZ011-01）。