吊灯花提取物体外抗氧化活性评价

吴兰芳，景永帅，张振东，杨 娟

（1.贵州大学生命科学学院，贵州贵阳550025；2.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州贵阳550002）

吊灯花提取物体外抗氧化活性评价

吴兰芳1，2，景永帅1，2，张振东1，2，杨 娟2，*

（1.贵州大学生命科学学院，贵州贵阳550025；2.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州贵阳550002）

目的：评价吊灯花提取物的体外抗氧化活性。方法：以乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水为样品提取剂，以VC作阳性对照，采用水杨酸法、二苯代苦味基肼自由基（DPPH·）法和Fe3+还原能力实验，对吊灯花不同极性溶剂提取物的体外抗氧化能力进行评价。结果：吊灯花各提取物均对羟基自由基有较强的清除作用，其中粗多糖的清除能力最强，半清除率浓度为0.61mg/mL，但效果不如VC明显；各提取物对DPPH自由基有很强的清除作用，以乙酸乙酯萃取物清除能力为最强，半清除率浓度为0.13mg/mL。同时以上提取物还对Fe3+具有很强的还原能力，其中石油醚提取物的还原能力最强。结论：吊灯花具有明显的抗氧化活性，在抗衰老方面有广泛应用前景。

吊灯花，抗氧化活性，自由基，还原力

吊灯花为萝藦科（Asclepiadaceae）吊灯花属（Ceropegia）植物［1］，又名灯笼花、假西藏红花［2］，该属植物约170种，分布于亚洲东南部，经印度、马达加斯加到非洲，中国产14种，四川、贵州、云南和广西等省区有栽培［3-4］。全草或根入药，具有清热解毒，补虚，祛风除湿等功效，主治劳伤虚弱，风湿关节痛，脚气病等［5］。据报道，吊灯花属植物灯心草吊灯花总生物碱成分有保肝、退热、止痛、局部麻醉、抗溃疡、降压等活性，且无毒副作用；从中分离出的吊灯花素是从自然界得到的第一个呋喃骈吡啶类生物碱，具有较强的止痛作用［6-8］。除此而外，关于吊灯花属植物的化学成分、现代药理研究方面的文献报道很少［9-10］。为了更好开发利用吊灯花资源，本实验运用水杨酸法、二苯代苦味基肼自由基（DPPH·）法、Fe3+还原能力的方法对吊灯花不同极性溶剂提取物体外抗氧化活性进行评价。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

吊灯花药材 2009年7月购自贵州省贵阳市万东桥药材市场，经贵阳中医学院陈德媛教授鉴定为长叶吊灯花（Ceropegia dolichpohylla Schltr.）；二苯代苦味基肼自由基（DPPH·） 百灵威公司；VC、无水乙醇、H2O2、水杨酸、硫酸亚铁、铁氰化钾、三氯化铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三氯乙酸 均为国产分析纯试剂。

HP-8453型紫外可见分光光度计 惠普公司；JA2003精密电子天平 上海恒平科学仪器有限公司；DK-98-11电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的提取和制备 将干燥的长叶吊灯花根135g粉碎，加80%乙醇回流提取6次，每次2h，乙醇提取液减压浓缩至无醇味，真空干燥后，得长叶吊灯花总醇提物。取20g醇提物用水混悬后依次用两倍体积的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取6次，各萃取液及萃取后的水层部分减压浓缩，经真空干燥后得石油醚提取物3.8g、氯仿提取物2.1g、乙酸乙酯提取物1.9g、正丁醇提取物4.9g及水层部分4.6g，作为待测样品置于干燥器中保存备用。

将乙醇浸提后的药材残渣在室温下挥去乙醇，加入蒸馏水，沸水浴提取6次，每次2h。合并水提液减压浓缩至一定的体积，加入乙醇沉淀多糖，乙醇最终浓度不低于80%，沉淀依次用95%的乙醇、丙酮洗涤后，真空干燥得长叶吊灯花粗多糖11.5g，作为待测样品置于干燥器中保存备用。

1.2.2 抗氧化活性测定

1.2.2.1 清除羟基自由基［11］采用 Fenton反应，利用H2O2与Fe2+混合产生羟基自由基，在该体系中加入水杨酸捕捉羟基自由基并产生有色物质，该物质在510nm处有最大吸收。取醇提部分萃取物各50mg，用无水乙醇溶解并定容至25mL；取粗多糖50mg，用蒸馏水定容至25mL，配制得质量浓度为2mg/mL的母液备用。加入一定浓度样品 4mL，9mmol/L FeSO40.5mL，9mmol/L水杨酸 0.5mL，8.8mmol/L H2O20.5mL，混匀，于 37℃水浴中加热30min，510nm测定样品吸光度（Ai），将体系中的样品改为加入4mL蒸馏水，测定得空白对照吸光度（A0），当向体系中加入0.5mL蒸馏水代替8.8mmol/L H2O2时，测定得样品本底吸光度（Aj），其中（Ai）每个质量浓度做三个平行，取平均值，以VC作阳性对照，按公式（1）计算清除率。

1.2.2.2 清除DPPH自由基［12-13］DPPH自由基是一种稳定的自由基，在有机溶剂中呈紫色，在517nm波长处有较大吸收，当加入抗氧化剂，一部分自由基被清除掉，使在该波长下的吸收减弱，可借此来评价某物质的抗氧化活性。取醇提部分萃取物各50mg，分别用无水乙醇溶解并定容至25mL；取粗多糖50mg，蒸馏水溶解并定容至25mL，配制得质量浓度为2mg/mL各样品，再以该质量浓度配制成所需浓度。以无水乙醇配制0.16mmol/L DPPH溶液，置于棕色容量瓶中。取3mL样品溶液加入3mL DPPH溶液于25℃水浴中加热15min后，在517nm测得试样吸光度（Ai），取3mL蒸馏水代替样品测得空白吸光度（A0），以3mL样品中加入3mL蒸馏水测得样品本底吸光度（Aj），其中（Ai）每个样品质量浓度做三个平行，取平均值。以VC作阳性对照，按公式（2）计算清除率。

1.2.2.3 Fe3+还原力实验测定［14］取2.5mL不同质量浓度的样品溶液，加入0.2mol/L磷酸缓冲液2.5mL及1%铁氰化钾2.5mL，50℃水浴反应20min后急速冷却，加入10%三氯乙酸溶液2.5mL混匀，过滤，取上清液5mL，加入0.02%三氯化铁溶液5mL，10min后立即于700nm处测定吸光值。吸光值越大则还原能力越强，以VC作为对照。

2 结果与讨论

2.1 对羟基自由基的清除作用

结果见图1和表1。图1显示，各部分提取物对羟基自由基都表现出一定程度的清除能力，且水溶性成分对羟基自由基的清除作用强于醇溶性成分，醇提物的各萃取部分随着极性增大而清除能力变弱，各部分的清除效果均弱于VC。在实验选取的质量浓度范围内，清除能力大小依次为：粗多糖部分＞水层部分＞总醇提取物＞石油醚提取物＞乙酸乙酯提取物＞氯仿提取物＞正丁醇提取物。

图1 清除羟基自由基作用

表1显示，长叶吊灯花提取物对羟基自由基清除活性的半清除率浓度（IC50）值顺序为：VC＜粗多糖＜水层部分＜石油醚提取物＜乙酸乙酯提取物＜总醇提取物＜氯仿提取物＜正丁醇提取物。半清除率浓度越小则清除能力越强。除乙酸乙酯提取物外，醇提物的各提取部分的半清除率浓度随着提取溶剂极性增大而增大。

2.2 对DPPH自由基的清除作用

DPPH自由基是一类较为稳定的芳香类自由基，天然抗氧化物质对DPPH自由基的清除能力被认为是抗氧化物质清除自由基的总能力［15］。结果见图2和表2。图2显示，长叶吊灯花水提取物和醇提取物均能清除DPPH自由基，其清除率随反应体系含提取物质量的增加而加大，在质量浓度相同的情况下，醇提取物对DPPH自由基的清除作用高于水提取物。但各部分的清除能力都低于VC，清除能力大小依次为VC＞乙酸乙酯提取物＞氯仿提取物＞总醇提取物＞石油醚提取物＞正丁醇提取物＞水层＞粗多糖。

表2显示，对DPPH清除作用的半清除率浓度（IC50）大小依次为VC＜乙酸乙酯提取物＜氯仿提取物＜总醇提取物＜石油醚提取物＜正丁醇提取物＜粗多糖＜水层部分。半清除率浓度大小与清除能力大小成负相关，即半清除率浓度越小，清除能力越大。结果表明，乙酸乙酯提取物部分清除DPPH自由基效果较好。

表1 长叶吊灯花提取物对·OH清除活性的IC50值

表2 长叶吊灯花提取物对DPPH·清除活性的IC50值

图2 清除DPPH自由基作用

2.3 Fe3+还原力的测定

抗氧化剂的抗氧化能力与其还原力有关，还原力越大，抗氧化能力越强。抗氧化剂能够在一定的条件下将 Fe3+还原为 Fe2+，因此，根据 Fe3+还原为Fe2+的多少来间接评价各种提取物的抗氧化能力。结果见图3。图3显示，各提取物的还原能力与其质量浓度呈正相关。醇提物的各萃取部分随着极性的增大，还原能力变弱。各部分的还原能力大小依次为：VC＞石油醚提取物＞氯仿提取物＞总醇提取物＞水层部分＞粗多糖部分＞乙酸乙酯提取物＞正丁醇提取物。

图3 对Fe3+的还原能力曲线

3 结论

自由基理论认为衰老是氧自由基过度反应的结果，有机体的新陈代谢速率越高，氧自由基的产生就越快，衰老过程就加快，清除自由基可起到延年益寿的作用［16］。在实验所选的三种体外抗氧化评价方法中，从对两种自由基的清除率和半清除率浓度看，长叶吊灯花各提取物对DPPH自由基的清除作用优于羟基自由基。在同一个抗氧化评价指标中，不同溶剂提取物的抗氧化能力存在较大差异，在羟基自由基的清除实验中，粗多糖的清除效果最强，醇提部分的活性集中体现在乙酸乙酯提取物和氯仿提取物。而在DPPH·实验中，醇溶性成分的清除能力比水溶性成分的强，尤其以乙酸乙酯提取物和氯仿提取物的清除效果为好。在铁离子的还原能力测定实验中，石油醚提取物对Fe3+的还原能力最强。由此可以看出，长叶吊灯花中的抗氧化活性成分除粗多糖外，主要集中在醇提物的中小极性部分。本研究为吊灯花的开发和应用提供了科学依据。

［1］张小卉，辜天琪，田先华，等.陕西省萝藦科一新记录属——吊灯花属［J］.西北植物学报，2008，28（2）：406-407.

［2］李万方.奇特的吊灯花［J］.中国花卉盆景，2002（12）：6.

［3］蒋英，李秉滔.中国植物志［M］.北京：科学出版社，1977，63：564-575.

［4］中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴［M］.第三册.北京：科学出版社，1983：871.

［5］何顺志，徐文芬.贵州中草药资源研究［M］.贵阳：贵州科技出版社，2007：546-547.

［6］Sukumar E，Gopal H，Rao R B，et al.Pharmacological actions of cerpegin，a novel pyridine alkaloid from Ceropegia juncea［J］. Fitoterapia，1995，66（5）：403-406.

［7］Nikam T D，Savant R S.Multiple shoot regeneration and alkaloid cerpegin accumulation callus culture of Ceropegia juncea Roxb［J］.Physiol Mol Biol Plants，2009，15（1）：71-77.

［8］Adibatti N A，Thirugnanasambantham P，Kuilothungan C.A pyridine alkaloid from Ceropegia juncea［J］.Phytochem，1991，30：2449-2450.

［9］Alasbahi R，Melzig M F.Screening of some Yemeni medicinal plants for inhibitory activity against peptidases［J］.Pharmazie，2008，63（1）：86-88.

［10］Alkalemji A，Paulsen E.Allergic occupational dermatitis due to Ceropegia woodii（string of hearts）［J］.Contact Dermatitis，2007，56（6）：367-369.

［11］刘春兰，刘海青，邓义红，等.沙棘叶水溶性多糖的分离纯化及体外清除自由基活性研究［J］.中药材，2006（2）：151-154.

［12］高春燕，田呈瑞，周默.枸杞多糖体外清除自由基活性研究［J］.三峡大学学报：自然科学版，2005（5）：456-458.

［13］柳建军，许立松，王菁菁，等.黄连木嫩叶抗氧化活性研究［J］.食品科学，2008，29（9）：45-47.

［14］刘朝霞，胡士德，邹坤，等.资木瓜乙醇提取物的体外抗氧化活性研究［J］.三峡大学学报：自然科学版，2008（4）：72-75.

［15］严奉伟，朱建飞，吴谋成.功能食品清除自由基活性评价方法及其进展［J］.长江大学学报：农学卷，2006，3（4）：214-217.

［16］徐敏.人体自由基与衰老的关系［J］.临床和实验医学杂志，2006，5（3）：289-290.

Evaluation on antioxidant activity of Ceropegia dolichpohylla extracts in vitro

WU Lan-fang1，2，JING Yong-shuai1，2，ZHANG Zhen-dong1，2，YANG Juan2，*
（1.College of Life，Guizhou University，Guiyang 550025，China；2.Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences，Guiyang 550002，China）

Objective：To evaluate on antioxidant activities of extracts from Ceropegia dolichpohylla in vitro.Methods：Salicylic acid method，DPPH·（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl）method and deoxidization Fe3+were used to evaluate the antioxidant activities in vitro of samples，which extracted using ethanol，petroleum ether，chloroform，ethyl acetate，n-butanol and water from Ceropegia dolichpohylla，respectively，and VCwas used as comparison sample.Results：The extracts had good scavenging activities for hydroxyl radical（·OH），especially crude polysaccharide showed the highest activity and its half elimination ratio（lC50）was 0.61mg/mL，but the activity was weaker than that of VC.The extracts had strong scavenging activities on DPPH radical，the effect of ethyl acetate extracts was the strongest and its lC50value was 0.13mg/mL.Meanwhile，the above extracts had stronger deoxidizing Fe3+activity，the activity of the petroleum ether extracts was the strongest.Conclusion：Ceropegia dolichpohylla has stronger antioxidative activity and will be widely applicated on antiaging.

Ceropegia dolichpohylla；antioxidetive activity；free radical；deoxidization

TS201.1

A

1002-0306（2010）11-0078-03

2010-01-06 *通讯联系人

吴兰芳（1985-），女，硕士研究生，研究方向：药食资源利用。

国家自然科学基金（30760297）；国家重点基础研究发展计划（2009CB526512）。