鲤鱼组织蛋白酶L活性的影响因素研究

侯鲁娜，陈学云，聂小华，刘 璘

（浙江工业大学生物与环境工程学院，浙江杭州310014）

鲤鱼组织蛋白酶L活性的影响因素研究

侯鲁娜，陈学云，聂小华*，刘 璘

（浙江工业大学生物与环境工程学院，浙江杭州310014）

主要研究了鲤鱼组织蛋白酶L活性的影响因素。结果表明，鲤鱼组织蛋白酶L具有较强的稳定性，在-20℃冻藏、20～50℃加热处理、不同酸性环境中均保留了一定程度的活性；鱼肉中组织蛋白酶L在漂洗工艺中并不能完全去除，漂洗后仍残存了45.65%活性。此外，鲤鱼组织蛋白酶L在豆科类蛋白、大米蛋白、鸡蛋清蛋白、马铃薯蛋白、茶多酚和大豆异黄酮等各种食品组分作用下，其活性发生明显的下降，且呈现良好的量效关系。

鲤鱼，组织蛋白酶L，影响因素

鲤鱼是我国淡水养殖的主要品种，养殖面积大，产量高［1］；但鉴于其肉质粗糙和土腥味，鲤鱼的鲜销受到很大程度的限制，急需进行深加工以提高其附加值。鱼糜制品是一类营养丰富、口味多样、实用方便的低胆固醇食品，深受消费者欢迎，是发展较快的一类水产食品。经多年的研究发现，鲤鱼完全适于用作鱼糜加工的原料［2-3］，但其产品普遍存在着弹性低、口感差等问题。国内外大量研究表明，组织蛋白酶L是主要影响鱼糜制品凝胶特性的内源性蛋白酶之一［4-5］。比如，An等报道在太平洋牙鳕鱼糜中，组织蛋白酶L是鱼糜中残存较多和具有内肽酶活性的组织蛋白酶［4］。虽然为非肌原纤维蛋白结合蛋白酶，组织蛋白酶L活性并未能在鱼肉漂洗工艺中完全去除［6］，在凝胶化过程中亦降解肌球蛋白，从而造成鱼糜凝胶劣化现象的产生。因此，本实验对影响鲤鱼组织蛋白酶L活性的冻藏条件、漂洗工艺、热处理、pH处理等因素进行了研究，同时初步探讨了不同食品组分对鲤鱼组织蛋白酶L活性的抑制作用，以期提高鲤鱼鱼糜制品的凝胶特性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

新鲜鲤鱼 每尾重800±50g，购于杭州市朝晖农贸市场，击晕，冰鲜运至实验室。

1.2 实验方法

1.2.1 粗酶液提取 取鲤鱼背部白肌肌肉10.00g，加入已预冷的4倍体积25mmol/L乙酸钠缓冲液（含5mmol/L L-Cys，pH5.0）进行匀浆，置于4℃下提取1.5h，4℃离心（10000r/min，20min），抽滤，滤液即为鲤鱼组织蛋白酶L的粗酶提取液。

1.2.2 鲤鱼组织蛋白酶L的活性测定 组织蛋白酶L活性参照Barret方法并加以改进［7］。取250μL酶液，依次加入250μL Brij35溶液（0.1%）、250μL反应缓冲液（340mmol/L乙酸钠-60mmol/L乙酸-4mmol/L EDTA-2Na，含8mmol/L DDT，pH5.5）后，加入Z-Phe -Arg-AMC底物溶液至终浓度为5μmol/L，混匀后于40℃反应10min，终止反应，离心取上清液，利用多功能酶标仪进行测定其荧光值，所用的激发波长为360nm，发射波长为460nm。

一个酶活单位（U）定义为在反应温度（40℃）及pH6.0下，能够在1min内水解底物并释放出1nmol AMC产物的酶活性量（1nmolAMC/min）。

1.2.3 鲤鱼的冻藏实验 取鲤鱼背部白肌，切成块状（40mm×20mm×15mm），置于-20℃下冻藏，定期取样测定其组织蛋白酶L的活性。

1.2.4 鲤鱼鱼糜的制备 参考王锡昌方法制备鱼糜［8］。将鲤鱼背部肌肉搅碎，按鱼∶水为1∶8比例依次进行2次清水漂洗和0.15%盐水漂洗，对各个阶段的鱼肉分别进行取样，测定其组织蛋白酶L的活性。

1.2.5 鲤鱼组织蛋白酶L的稳定性实验 参照李树红的方法［9］，对粗酶液进行酸化处理后，离心所得上清液进行40%和80%硫酸铵分级沉淀，收集沉淀，溶解、透析，所得透析液用于组织蛋白酶L的稳定性实验。

1.2.5.1 热稳定性实验 将上述处理的组织蛋白酶L酶液分别置于20、30、40、50、60、70、80℃下加热处理，每隔一定时间取样，冷却后测定其活性。

1.2.5.2 pH稳定性实验 将上述处理的组织蛋白酶L酶液分别调整pH为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，于20℃下处理30min后，回调pH至6.0，测定其活性。

1.2.6 组织蛋白酶L的抑制实验 取250μL酶液，依次加入250μL Brij35溶液（0.1%）、250μL反应缓冲液后，加入不同浓度的食品组分，然后加入Z-Phe -Arg-AMC（底物溶液至终浓度为5μmol/L），混匀后于40℃反应10min，终止反应，离心取上清液，利用多功能酶标仪进行测定其荧光值，所用的激发波长为360nm，发射波长为460nm。

2 结果与讨论

2.1 冻藏对鲤鱼组织蛋白酶L活性的影响

鱼类鲜水产品极易腐败变质，且其生产具有明显的季节性，产量高度集中，因此加工中常采用冻藏方式保存鱼类原料。本实验将鲤鱼置于-20℃下进行贮藏，动态检测了其组织蛋白酶L活性的变化，结果如图1所示。由图1可知，冻藏期间鲤鱼组织蛋白酶L活性呈现不断下降的趋势，经冻藏6个月后，其活性由 4.83U/g鱼肉降至 3.83U/g鱼肉，下降了20.81%，这表明了鲤鱼组织蛋白酶L在冻藏过程中具有较强的稳定性。J Shann-tzong等亦报道了相似的结果，鲭鱼鱼糜在-40℃环境中贮藏8周后，其组织蛋白酶B和L活性残存了约80%［10］。

图1 鲤鱼冻藏后组织蛋白酶L的活性变化

2.2 漂洗对鲤鱼组织蛋白酶L活性的影响

鱼糜加工过程中，一般采用2次清水漂洗和盐水漂洗方式以去除鱼肉中水溶性蛋白，从而达到提高产品弹性和白度的目的。实验考察了鲤鱼鱼糜加工中组织蛋白酶L的残存情况，结果如图2。研究发现，漂洗工艺可在一定程度上降低鱼肉中组织蛋白酶L的活性，但并不能完全去除该酶，该结果与李树红［9］等的报道相一致。经第一次清水漂洗后，鱼肉中组织蛋白酶L活性显著减少，下降了34.58%；经2次清水漂洗和0.15%盐水漂洗后，鲤鱼鱼肉中仍残存了45.65%的组织蛋白酶L。

图2 漂洗对鲤鱼组织蛋白酶L的活性影响

2.3 鲤鱼组织蛋白酶L的稳定性实验

2.3.1 加热处理对鲤鱼组织蛋白酶L活性的影响已有研究表明，组织蛋白酶是一类耐热性半胱氨酸蛋白酶，在鱼糜加热胶凝过程中可能残存一定的活性，从而导致凝胶劣化的产生［11］。由图3可知，鲤鱼组织蛋白酶L具有较强的耐热性，40℃下加热处理30min和60min后，组织蛋白酶 L活性分别降至68.78%和59.69%；50℃下加热处理30min和60min后，组织蛋白酶L活性分别降至38.26%和33.97%；而加热温度大于60℃时，鲤鱼组织蛋白酶L基本失活，其活性降至4%以下。

图3 鲤鱼组织蛋白酶L的热稳定性

2.3.2 pH对鲤鱼组织蛋白酶L活性的影响 本实验研究了不同pH环境下鲤鱼组织蛋白酶L活性的变化，结果如图4所示。研究表明，鲤鱼组织蛋白酶L具有较强的耐酸性，pH4.5～5.5下处理30min，其活性基本保持85%以上；pH3.0下处理30min，组织蛋白酶L仍保留了47.62%活性；当pH≥7.0后，鲤鱼组织蛋白酶L活性发生明显下降，其相对活性仅为0.62%。该结果与鲢鱼组织蛋白酶的pH稳定性相类似［12］。

图4 鲤鱼组织蛋白酶L的pH稳定性

2.4 食品组分对鲤鱼组织蛋白酶L的抑制作用

近年来，从食品组分中筛选安全、高效的酶抑制剂已成为改善鱼糜凝胶强度的研究焦点［13-15］。实验中研究了豆科类蛋白、马铃薯蛋白、大米蛋白、鸡蛋清蛋白、大豆异黄酮和茶多酚等食品组分对鲤鱼组织蛋白酶L活性的影响，结果见图5。由图可知，5～30mg/mL豆科类、马铃薯、大米、鸡蛋清等蛋白均对鲤鱼组织蛋白酶L表现出明显的抑制作用，且呈现良好的量效关系，其中鸡蛋清蛋白对组织蛋白酶L的抑制效果最强，马铃薯蛋白次之，当蛋白质浓度为5mg/mL时，其抑制率分别为34.5%和23.6%；豆科类蛋白对鲤鱼组织蛋白酶L的抑制大小分别为：黄豆＞绿豆＞红豆＞蚕豆。此外，大豆异黄酮和茶多酚亦显著抑制鲤鱼组织蛋白酶L活性，当添加量为2mg/mL时，其抑制率分别为49.0%和38.0%。实验结果说明，大豆异黄酮、茶多酚等双黄酮物质是潜在的、高效的组织蛋白酶L抑制物质，有待于进一步深入研究其对鱼糜胶凝的影响。

图5 不同食品组分对鲤鱼组织蛋白酶L的抑制效果

3 结论

3.1 经-20℃冻藏6个月，鲤鱼组织蛋白酶L活性下降了20.81%，这说明其在冻藏过程中具有较强的稳定性。

3.2 漂洗工艺可在一定程度上降低鱼肉中组织蛋白酶L的活性，但并不能将其完全去除，经2次清水漂洗和 0.15%盐水漂洗后，鲤鱼鱼肉中仍残存了45.65%的组织蛋白酶L。

3.3 鲤鱼组织蛋白酶L具有较强的热稳定性和酸稳定性。20～50℃下加热处理下和pH≤7.0酸性环境中，鲤鱼组织蛋白酶L仍保留了一定的活性。

3.4 豆科类、马铃薯、大米、鸡蛋清等蛋白均对鲤鱼组织蛋白酶L表现出明显的抑制作用。大豆异黄酮和茶多酚亦显著抑制鲤鱼组织蛋白酶L活性，有待于进一步深入研究上述食品组分对鱼糜凝胶特性的影响。

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Study on influence factors of cathepsin L in common carp

HOU Lu-na，CHEN Xue-yun，NIE Xiao-hua*，LIU Lin
（College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

The influence factors of cathepsin L in common carp were studied.From the results，cathepsin L in common carp exhibited strong stability and kept certain activities during the process of-20℃ frozen，20～50℃heating and acid treatment.Cathepsin L in common carp still reserved 45.65%activity after washing process. Meanwhile，cathepsin L in common carp were obviously inhibited by bean proteins，rice protein，egg protein，potato protein，polyphenols and soy isoflavones in a dose-dependent manner.

common carp；cathepsin L；influence factors

TS254.1

A

1002-0306（2010）11-0075-03

2010-03-11 *通讯联系人

侯鲁娜（1983-），女，硕士研究生，主要从事食品生物技术方面的研究。

国家863项目（2007AA09Z442）；浙江省自然科技项目基金（Y307132）。