金针菇F19产多糖液体发酵条件优化

朱建勇

（重庆文理学院生命科学与技术学院，重庆402168）

金针菇F19产多糖液体发酵条件优化

朱建勇

（重庆文理学院生命科学与技术学院，重庆402168）

为研究金针菇液体发酵获得多糖的最佳非营养因子，以金针菇杂交菌种F19为试材，采用单因素实验和正交实验研究了非营养因子对金针菇液体发酵多糖产量的影响。结果表明，金针菇F19液体发酵多糖产量收率最好的非营养因子发酵条件为：菌龄48h、接种量10%、起始pH7.5、发酵温度26℃、摇床转速130r/min、发酵时间7.5d，多糖得率为1.86mg/mL。

金针菇，非营养因子，液体发酵，多糖

金针菇［Flammulina velutipes（Fr.）Sing.］又名冬菇、朴菇、构菌、青杠菌、毛柄金钱菌，隶属担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，口蘑科，金钱菌属［1］。金针菇多糖有很强的免疫调节和抗肿瘤活性［2-7］，对化疗药环磷酰胺也有增效减毒作用［8］，还具有抗疲劳、降血浆胆固醇、延长寿命、抗凝血、抗艾滋病病毒（HIV）、消除自由基和抗动脉粥样硬化等药理作用等功效［9-12］。本研究采用了单因素和正交组合实验研究了菌龄、接种量、起始pH、发酵温度、摇床转速、发酵时间6个因素对金针菇F19液体发酵多糖产量的影响，旨在探索金针菇多糖最大收率时的非营养因子发酵最优条件，为金针菇多糖产品的工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

杂交金针菇菌种F19 由四川成都食用菌研究所提供；活化培养基 马铃薯200g（去皮煮汁）、葡萄糖（AR）20g、琼脂18g、KH2PO4（AR）1.5g、MgSO4（AR）1.0g，pH自然，配制成1000mL；种子培养基活化培养基去琼脂；液体发酵培养基 马铃薯200g（去皮煮汁）、葡萄糖10g、可溶性淀粉30g、玉米粉30g、KCl 1.0g、VB2100mg，配制成1000mL；蒽酮、95%乙醇、丙酮、乙醚 分析纯；浓硫酸、浓盐酸、氢氧化钠 化学纯。

1.2 金针菇液体发酵培养

在250mL三角瓶中装入100mL发酵培养基，用八层纱布封口，高温灭菌30min，冷却后，在无菌条件下接入液体菌种，按下列实验设计进行发酵培养，培养结束后，测定多糖的收率。

1.2.1 单因素实验

1.2.1.1 菌龄对多糖产量的影响 分别用24、48、72、96、120h不同菌龄的液体菌种，按10%接种发酵瓶，在25℃、110r/min、pH自然条件下培养5d，设三个重复。

1.2.1.2 接种量对多糖产量的影响 采用48h菌龄分别按5%、10%、15%、20%、25%接种量接种发酵瓶，在25℃、110r/min、pH自然条件下培养5d，设三个重复。

1.2.1.3 发酵温度对多糖产量的影响 采用48h菌龄按10%接种量接种发酵瓶，分别在21、23、25、27、29℃温度水平、110r/min、pH自然条件下培养5d，设三个重复。

1.2.1.4 起始pH对多糖产量的影响 采用48h菌龄按10%接种量接种发酵瓶，分别在6.0、6.5、7.0、7.5、8.0起始 pH水平、110r/min、25℃条件下发酵培养5d，设三个重复。

1.2.1.5 摇床转速对多糖产量的影响 分别用110、130、150、170、190r/min的转速，48h菌龄、10%接种量接种发酵瓶、pH自然、25℃条件下发酵培养5d，设三个重复。

1.2.1.6 发酵时间对多糖产量的影响 发酵时间分设5、6、7、8、9d五个水平，48h菌龄、10%接种量接种发酵瓶、pH自然、110r/min、25℃条件下发酵培养，设三个重复。

1.2.2 正交实验设计 根据以上单因素实验分析结果确定选入正交实验的因子及水平，采用L9（34）正交设计，选择菌龄（A）、温度（B）、摇床转速（C）、发酵时间（D）4个因素，各因素选取3个水平。然后参照正交表分别选择4因素3水平进行正交实验（见表1），对金针菇液体发酵非营养因子条件进行优化。

表1 正交实验的因素水平表

1.2.3 多糖提取与测定 参照孙居明等的方法［13］。

1.2.4 数据处理 方差分析和显著性分析采用DPS7.05数据处理系统进行。

2 结果与分析

2.1 单因素结果分析

2.1.1 菌龄对多糖产量的影响 不同菌龄接种后，将实验结果进行单因素方差分析和LSD法显著性分析，结果见表2、表3。由表2可知，不同菌龄接种对多糖产量的影响达显著水平。由表3可以看出，当菌龄在24～72h之间时，随着菌龄的增长，多糖的含量呈现极显著提高，但随菌龄的继续增大，多糖含量反而呈现下降趋势。菌龄48、72h多糖收率较高，且与其它水平均达到极显著性差异，故将48～72h菌龄确定为正交实验的水平区间。

表2 菌龄单因素实验方差分析

表3 菌龄对多糖产量影响的显著性分析

注：不同小写字母表示0.05水平上差异显著；不同大写字母表示0.01水平上差异显著，表5、表7、表9、表11、表13同。

2.1.2 接种量对多糖产量的影响 对不同接种量的实验结果进行方差分析和LSD法显著性分析，结果见表4、表5。由表4可知，不同接种量对多糖产量的影响达显著水平。由表5可以看出，当接种量在10%～25%之间时，多糖的含量无显著性差异，但分别与接种量5%相比，均呈极显著性差异，且前者多糖的含量较高。在实际生产中，为了节约成本，10%的接种量即为金针菇F19液体发酵多糖产量的最佳接种量。

表4 接种量单因素实验方差分析

表5 接种量对多糖产量的影响的显著性分析

2.1.3 发酵温度对多糖产量的影响 对不同发酵温度的实验结果进行方差分析和LSD法显著性分析，结果见表6、表7。由表6可知，不同温度对多糖产量的影响达显著水平。由表7可以看出，在0.05和0.01显著水平上，25、27℃之间和23、29、21℃之间均无显著差异，但它们分别与其它水平均存在极显著性差异，且前者多糖的含量明显高于后者，可见应将25～27℃纳入正交实验再进行筛选。

表6 发酵温度单因素实验方差分析

表7 发酵温度对多糖产量的影响的显著性分析

2.1.4 起始pH对多糖产量的影响 对不同起始pH发酵培养所得实验数据进行方差分析和LSD法显著性分析，结果见表8、表9。由表8可知，不同起始pH发酵培养所得多糖产量的影响呈显著差异。由表9可见，起始pH7.5分别与其他水平呈极显著差异，而其他水平之间无显著性差异，且起始pH7.5时所得多糖含量达最高，是液体发酵最佳起始pH。

表8 起始pH单因素实验方差分析

表9 起始pH对多糖产量影响的显著性分析

2.1.5 摇床转速对多糖产量的影响 对不同摇床转速发酵培养所得实验数据进行方差分析和LSD法显著性分析，见表10、表11。由表10可知，不同摇床转速发酵培养所得多糖产量的影响呈显著差异。由表11可见，摇床转速在130～170r/min间无显著性差异，与110、190r/min比较其多糖产量较高，故拟将130～170r/min水平纳入正交实验。

表10 转速单因素实验方差分析

表11 转速对多糖产量的影响的显著性分析

2.1.6 发酵时间对多糖产量的影响 对不同发酵时间培养所得实验数据进行方差分析和LSD法显著性分析，结果见表12、表13。由表12可知，不同发酵时间培养所得多糖产量的影响呈显著差异。由表13可见，7～8d多糖产量达到峰值，第9d开始下降。故将7～8d纳入正交实验。

表12 发酵时间单因素实验方差分析

表13 发酵时间对多糖产量的影响的显著性分析

2.2 正交实验结果与分析

按L9（34）正交实验设计表的各种条件进行实验，其结果见表14。由表14可以看出，影响多糖产量的各个因素主次排序为B＞A＞D＞C，最佳金针菇液体发酵非营养因子发酵条件为：A1B2C1D2，即菌龄48h、温度26℃、摇床转速130r/min、发酵时间7.5d，经验证实验，多糖得率1.86mg/mL。

3 结论

综合单因素实验和正交实验的结果可得，金针菇F19液体发酵多糖产量最大收率的非营养因子发酵条件为菌龄48h、接种量10%，起始pH7.5，发酵温度26℃、摇床转速130r/min、发酵时间7.5d，多糖得率1.86mg/mL。

表14 正交实验结果

［1］毕志树，郑国扬，李泰辉.广东大型真菌志［M］.广东：广东科技出版社，1994.

［2］Ikekawa，T，Ikeda，Y，Yoshioka，Y.Studies on antitumor polysaccharides of Flammulina velutipes（Curt.ex Fr）Sing.II.The structure of EA3 and furtherpurification of EA5［J］.J Pharm Dyn，1982，5：576-581.

［3］曾庆田.金针菇多糖的抗肿瘤作用［J］.中国食用菌，1991，10（2）：11-13.

［4］Gong F，Chen Y.Crystallization and some characterization of Flammulin purified from the fruit bodies of Flammulina velutipes［J］.Bioresource Technology，1998，64：153-156.

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［6］严茂祥，陈芝芸，项柏康，等.金针菇多糖对小鼠移植性肿瘤抗瘤效应研究［J］.中国中医药科技，1999，6（6）：379-380.［7］朱曙东，严茂祥，陈芝芸，等.金针菇多糖免疫活性的研究［J］.浙江中医学院学报，2001，25（4）：43-44.

［8］袁强，陈芝芸，严茂祥.金针菇多糖对环磷酰胺增效减毒作用［J］.中国中药杂志，2005，30（12）：933-935.

［9］文静，陈文，王津，等.金针菇抗疲劳的实验研究［J］.营养学报，1993，15（1）：79-81.

［10］吴锦文.食用菌的医疗保健功能和改善食物结构的作用［J］.中国食用菌，2003（4）：9-11.

［11］郑立明，曹长华，张长琳.金针菇口服液对果蝇和家蝇寿命的影响［J］.中国食用菌，1990，9（3）：7-8.

［12］陈福禄，谢宝贵，郑金贵.药用菌多糖的药用功能与展望［J］，中国药学杂志，2005，40（4）：244-248.

［13］孙居民，张巨明，等.金针菇液体深层发酵多糖的提取与测定［J］.石河子大学学报：自然科学版，1999，3（1）：36-40.

Effects of non-nutritional factors for liquid fermentation of Flammulina Velutipes on the yield of polysaccharide

ZHU Jian-yong
（College of Life Sciences and Technology，Chongqing University of Arts and Sciences，Chongqing 402168，China）

The aim was to study the optimum non-nutritional factors for liquid fermentation of Flammulina Velutipes of F19 to obtain polysaccharide.Using single factor experiments and orthogonal tests，the effect of non-nutritional factors on the yield of polysaccharide by liquid fermentation of Flammulina velutipes was studied.The results showed that the optimum condition of liquid fermentation on the biggest yield of polysaccharide was seed age 48h，inoculation amount 10%，initial pH 7.5，culture temperature 26℃，rotational speed 130r/min and fermentation time 7.5d，the yield of polysaccharide was 1.86mg/mL。

Flammulina velutipes；non-nutritional factors；liquid fermentation；polysaccharide

TS201.3

A

1002-0306（2010）12-0182-03

2009-12-07

朱建勇（1966-），男，高级实验师，硕士，研究方向：应用微生物。

重庆文理学院重点资助项目（Z2008SK18）。