新加良附方对移植性人胃癌细胞Bax/Bcl-2表达影响

田劭丹 董 青 侯 丽 陈信义

依据胃癌临床表现可将其归属于中医“反胃”、“噎嗝”、“痞满”、“胃脘痛”等病证范畴。通过临床观察，我们认为，胃癌发病的关键是“脾阳不振，内外寒邪交织”导致“寒凝血瘀、集结胃府、阻滞气机”的复杂病机变化过程[1]。在疾病进展或相关治疗中可出现多态性复杂证候群。依据“治病求本”中医理论，我们在临床中根据温中散寒、活血化瘀、理气止痛的治则，采用由《良方集腋》中的良附丸加味而成的新加良附方治疗胃癌，取得了较好的效果。新加良附方由高良姜、香附、穿山龙组成。已有体外实验证实新加良附方对人胃癌细胞BGC-823等具有明显抑制作用[2]，为进一步探讨其抗肿瘤机制，我们采用免疫组织化学法从分子水平观测新加良附方诱导胃癌细胞凋亡的影响因素。

1 材料与方法

1.1 动物与细胞系

BALB/C-nu裸鼠50只，6～8周龄，SPF级，雌雄各半，由中国医学科学院肿瘤研究所肿瘤医院动物室繁育并提供，动物生产合格证号：京动许字（1999）第015号，动物合格证号：SCXK京2004-0006，在动物实验中心屏蔽系统辅以洁净层流柜环境中饲养。人胃癌（BGC-823）细胞系，由中国医学科学院肿瘤研究所检测中心常规保存并提供。

1.2 药物

新加良附方浸膏由西安新华药物研究所与北京博诺瑞特科技发展有限公司制备并提供，干燥保存，使用时以双蒸水稀释至实验所需浓度。注射用5-氟尿嘧啶（5-FU）由上海旭东海普药业有限公司生产，批号为：061210。

1.3 仪器及试剂

超净工作台系苏州宏瑞净化科技有限公司生产(型号SCW-CJ)；实验用离心机系江苏恒瑞制药机械有限公司生产(型号LS150)；倒置显微镜系日本NIKON株式会社生产(型号TS100)；Forma恒温培养箱为美国Forma公司产品（型号3111）；奥林巴斯显微镜DP71。Bax、Bcl-2等抗体及DAB显色增强剂均为美国Santa Cruz公司产品，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.4 方法

1.4.1 细胞复苏

液氮罐中取出含有BGC-823细胞的冻存管，放入37℃水浴内，使其溶化，吸取细胞悬液，加入离心管并滴加培养液至10mL，离心1000r/min，5min，去上清液，加入PBS液后细胞计数，调整细胞悬液浓度至1×107个细胞/mL，每只裸鼠以0.2mL接种于右腋下，待肿瘤长至体积约为1000mm3时移植。

1.4.2 造模及分组

选择生长良好、瘤块无破溃的荷瘤裸鼠，脱颈处死，无菌条件下剥离瘤块，用生理盐水洗去血渍，剪开瘤块，清除中心坏死组织，充分匀浆制备瘤细胞悬液，加生理盐水稀释细胞数至1×107个细胞/mL。取0.2mL/只，接种于裸鼠右腋窝皮下，接种在30min内完成。待肿瘤体积在100～300mm3（50只裸鼠造模全部成功）时，根据性别分层，按肿瘤体积大小随机分为模型对照组、5-FU组及新加良附方高、中、低剂量组，每组10只。

1.4.3 给药剂量及方法

给药剂量均采用人与动物剂量换算法确定。①模型对照组，以生理盐水每天0.2mL/10g灌胃；②5-FU组，按17mg/(d•kg)体质量腹腔注射，每周2次。③新加良附方中剂量组，以每天5g/(d•kg)灌胃，相当于成人剂量的15倍，成人剂量为0.35g/(d•kg)，以此为基础，高剂量组乘以2[10g/(d•kg)]，低剂量组除以2[2.5g/(d•kg)]。分组当天开始给药，连用15d。停药2d后处死裸鼠，取瘤块，石蜡包埋。

1.4.4 免疫组织化学标本制备

在新加良附方体内抑瘤实验中，随机选择5组中每组6只荷瘤小鼠的肿瘤组织。取各实验组的肿瘤组织标本（约1cm×1cm×2cm大小），用10%中性缓冲福尔马林液在室温或 4℃条件下固定，在60℃以下环境内经脱水、透明、浸蜡及包埋制成蜡块。

1.4.5 Bax/Bcl-2蛋白检测

组织切片常规脱蜡、水化后，按相关试剂盒说明检测Bax/Bcl-2蛋白表达。结果判断：Bax、Bcl-2蛋白阳性反应为黄色到棕褐色，定位于胞质亦可见于胞膜和核膜。各组每个指标选取肿瘤组织6个组织切片，每片选2个视野，用美国IMAGE-PRO5.0图像分析系统作图像分析，测定光密度（IOD）值。

1.4.6 计算与统计学处理

2 结 果

2.2 Bax/Bcl-2检测结果

实验各组Bax/Bcl-2检测结果见表1与图（×400）1～图10。

表1 实验各组Bax/Bcl-2检测IOD值比较（±s）

表1 实验各组Bax/Bcl-2检测IOD值比较（±s）

与模型组比较，*P＜0.05，** P＜0.01；与5-Fu组比较，△P＜0.01

组别 Bax Bcl-2模型对照组 44671.73+10447.96△ 61239.70+18318.94△5-FU组 57136.51+7760.15* 39423.79+20522.71**新加良附高剂量组 59413.69+15065.66** 43752.65+8655.47*新加良附中剂量组 52106.80+15117.84 41357.76+16910.16*新加良附低剂量组 51814.14+12905.17 49659.75+13720.94△

从表1可以看出，Bax表达在用药各组均有所升高，而Bcl-2表达均有所降低。与胃癌模型组相比，西药5-FU对照组、新加良附高剂量组Bax蛋白表达升高明显，有统计学意义（P＜0.05）；西药5-FU对照组、新加良附高、中剂量组Bcl-2蛋白表达下降明显，有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨 论

Bcl-2及Bax基因是Bcl-2基因家族中研究最深入最广泛的基因。Bcl-2即B细胞淋巴瘤/白血病基因2（B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2），是1984年Tsujimoto等从人类B细胞滤泡性淋巴瘤相关的t（14；18）染色体易位的断裂点克隆到的[3]。当染色体发生易位时，Bcl-2基因从染色体18q21易位到染色体14q32，与编码免疫球蛋白重链的基因JH片段形成Bcl-2/JH融合基因，引起Bcl-2基因表达失调。Bcl-2蛋白是一种跨膜蛋白，是调节凋亡过程的重要基因，它本身无促进增殖作用，也无促进细胞恶性转化作用，但它可以在无生长因子或神经营养因子存在的条件下通过抑制凋亡延长细胞存活时间，增加细胞染色体畸变和病毒感染机会，导致细胞恶变和促进肿瘤的发生与发展[4]。分布于线粒体外膜上的Bcl-2蛋白，具有稳定线粒体膜的功能。在细胞发生凋亡时，线粒体发生一系列与细胞凋亡密切相关的变化。其中以线粒体膜通透性的转变（permeability transition，PT）尤为重要。Bcl-2蛋白通过作用于线粒体引起线粒体膜通透性的改变，诱发细胞凋亡。PT孔是横跨在线粒体内外膜之间的高电导性非选择性通道。PT孔和线粒体外膜上的Bcl-2之间存在紧密的功能和形态学的联系，研究发现具有抗凋亡和促凋亡两种作用的Bcl-2家族蛋白可能参与PT孔的组成，而线粒体PT孔的开放是引起细胞凋亡的直接原因。另外，Bcl-2蛋白可以阻断Ca2+从内质网释放，使依赖Ca2+的核酸内切酶活性降低，从而阻断细胞凋亡。Bax（Bcl-2 accociated X protein）为Bcl-2基因家族中的细胞凋亡促进基因。实验中Bax的过表达可拮抗Bcl-2的保护效应而使细胞趋于凋亡。Bax与Bcl-2可形成异源二聚体或自身形成同二聚体。而Bax/Bcl-2异源二聚体形成的调节是细胞凋亡调控中一个非常重要的环节。目前认为Bcl-2家族凋亡诱导基因Bax等和凋亡抑制基因Bcl-2等的相对表达水平决定了细胞对凋亡信号的反应性。当Bcl-2超表达时，它与Bax形成异二聚体，凋亡被抑制。当Bax在细胞内超表达时，细胞对死亡信号的反应性增强，细胞发生凋亡。因此，Bcl-2与Bax比例决定细胞凋亡程度[5]。尽管Bcl-2家族蛋白调控细胞凋亡的确切机制还不是很清楚，但是Bcl-2蛋白均能抑制FAS介导的细胞凋亡，它是通过抑制caspases的活化，在其上游发挥抑制凋亡的作用；它还能阻止细胞色素C从线粒体释放，而细胞色素C是诱导caspases活化的重要成分。许多研究表明Bcl-2在caspases成为具有催化活性的形式时或在此之前就发挥了抗凋亡作用。所以，最近的研究把它们作为抗癌治疗的潜在靶点。

图1 模型对照组Bcl-2表达

图2 5-FU组Bcl-2表达

图3 良附高剂量组Bcl-2表达

图4 良附中剂量组Bcl-2表达

图6 模型对照组Bax表达

图7 5-FU组Bax表达

图8 良附高剂量组Bax表达

图9 良附中剂量组Bax表达

图10 良附低剂量组Bax表达

本实验采用胃癌裸鼠移植瘤模型，用免疫组织化学法检测Bcl-2、Bax等对细胞凋亡起重要调节作用的基因，考察新加良附方诱导胃癌细胞凋亡作用机理。实验表明，新加良附方能通过上调肿瘤组织Bax蛋白表达，下调Bcl-2蛋白表达，从而诱导胃癌细胞发生凋亡。这一重要研究结论预示新加良附方在肿瘤治疗中具有广泛的应用前景。我们还将从不同层次探索新加良附方抗胃癌作用靶点，揭示新加良附方抗胃癌机制，为推广应用及新药研发提供基础研究依据。

[1]刘雪强,陈信义.浅谈恶性肿瘤因于寒论及其临床运用[J].中医杂志,2004,45(12):849-949.

[2]庄严,董青,陈信义,等.新加良附药物血清体外抑制肿瘤细胞活性研究[J].北京中医,2007,26(5):308-310.

[3]Baliga BC,Kumar S. Role of Bcl-2 family of proteins in malignancy[J].Hematol Oncol,2002,20(2):63-74.

[4]Xu J,Xu Z,Jiang Y.Cryptorchidism induces mouse testiculargem cell apoptosis and changes in Bcl-2 and Bax protein espression[J].J Environ Pathol Toxicol Oncol,2000,19 (1/2):25-33.

[5]Korsmeyr SJ. Bcl-2 gene family and the regulation of programmed cell death[J]. Cancer Res,1999,59(7 Supp):1693s-1700s.