干酪乳杆菌纯种发酵大豆乳工艺研究

王 佳 田洪涛 韩 璞 张丽芳 蔡 毅

(河北农业大学食品科技学院,保定 071001)

干酪乳杆菌纯种发酵大豆乳工艺研究

王 佳 田洪涛 韩 璞 张丽芳 蔡 毅

(河北农业大学食品科技学院,保定 071001)

以从益生菌乳制品中自行分离选育出的生长繁殖力强、发酵活力高的干酪乳杆菌 (05-20)为试验菌株。通过正交试验研究了干酪乳杆菌纯种发酵大豆乳的工艺条件。结果表明:干酪乳杆菌发酵含有 20%牛乳和 7%蔗糖的大豆乳(豆与水的比例为 1∶10)培养基的最适工艺条件为:总接种量 7%(活菌数约为 7× 107cfu/mL),基质起始 pH 7.0,发酵温度 37℃,有氧条件发酵;采用最适工艺条件进行干酪乳杆菌发酵大豆乳,凝乳时间为 5 h,发酵产品的总活菌数为 2.3×109cfu/mL,pH 4.5,滴定酸度 80.2°T;发酵产品呈乳白色,凝乳良好,质地细腻,酸甜适口,具有浓郁的豆香和发酵香气。本研究为工业化生产干酪乳杆菌发酵大豆酸乳产品及其推广应用提供了科学依据,同时也为研制和开发其他多功能益生菌豆乳制品提供了新的思路和方法。

干酪乳杆菌 发酵 大豆酸乳 工艺

益生菌(probiotics)是指与人和动植物体保持共生关系的且对宿主具有健康促进作用的一大类微生物的总称。益生乳酸菌是一类最具有代表性的能够利用可发酵性糖类产生乳酸的益生菌,具有抗氧化活性,可以调节机体胃肠道正常菌群,抗肿瘤,免疫赋活等作用[1-2]。目前,国际公认的与人体共生的益生乳酸菌主要有:双歧杆菌 (B ifidobacteria)、嗜酸乳杆菌 (Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌 (Lactoba2 cillus casei)、罗伊氏乳杆菌 (Lactobacillus reuteri)等[3]。而一般的乳酸菌,如用于酸奶发酵的保加利亚乳杆菌 (Lactobacillus bulgaricus)和嗜热链球菌(Streptococcus ther m ophilus),虽对人体健康具有有益作用,但不能很好定植在人体肠道,对人体健康的有益作用大打折扣。干酪乳杆菌是在健康人体肠道中发现并分离出来,并用于生产酸乳饮料,但干酪乳杆菌发酵大豆乳产品并不多见。

干酪乳杆菌作为典型的益生菌,其营养要求除了需要水、碳源、氮源、无机盐之外,还需要多种生长因子。大豆是遍及全球的主要粮食作物,它分布广、产量颇高。鲜大豆中含碳水化合物、蛋白质、脂肪以及丰富的维生素和矿物质,尤其是含有大豆异黄酮、大豆抗氧化活性肽[4]等对人体有益。大豆异黄酮是目前大豆及其发酵制品中最引人注目的一种功能性成分,它具有抗氧化、抗肿瘤等生物活性及对人体骨质的药性作用[5]。大豆乳不仅在营养成分和功能性成分方面可与牛乳相媲美,而且不含胆固醇和乳糖,可防止动脉硬化和乳糖不耐症的发生。所以,本试验探讨采用干酪乳杆菌纯种发酵大豆乳工艺的可行性。

以从益生菌乳制品中自行分离选育出的干酪乳杆菌(05-20)为试验菌株,研究干酪乳杆菌纯种发酵大豆乳的工艺条件。为工业化生产干酪乳杆菌纯种发酵大豆酸乳产品及其推广应用提供科学依据,同时为研制和开发其它多功能益生菌豆乳制品提供新的思路和方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei)05-20,由河北农业大学食品科技学院发酵工程实验室从益生菌乳制品中分离选育的优良菌株,该菌株按 1%(活菌数约 1×107cfu/mL)接入液体MRS培养基 37℃培养16 h即可到对数生长末期,活菌数 1.6×109cfu/mL;将活化好的菌体按 5%(活菌数约 5×107cfu/mL)接入无菌脱脂乳中,37℃培养 5 h左右即可凝乳坚实。

1.1.2 主要原料和试剂

1.1.3 培养基

MRS培养基[6]:其中液体用于菌种活化,固体用于菌种活菌数检测。脱脂乳培养基 (脱脂奶粉与蒸馏水质量体积比为 1∶7):用于检测菌种活力。大豆乳培养基 (豆与蒸馏水比例为 1∶10,磨成豆浆):用于菌种活化和发酵剂制备。

1.2 主要仪器设备

FLC-3超净台:哈尔滨市东联公司;YXQ﹣SU46﹣ 280S高压灭菌锅、SPX-150B-Z生化培养箱:上海博迅实业有限公司;FOM-Z150-2磨浆机:镇江市丹徒区纪中电器厂;SIS60-70实验型高压均质机:上海申鹿均质机有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种的活化

将干酪乳杆菌按1%(体积比)接种于试管MRS液体培养基中,37℃培养,活化 1～3次,使培养时间在 12～18 h内活菌数达到 1×109cfu/mL以上。将1%试管MRS菌液分别接种于试管无菌脱脂乳培养基中,37℃培养,活化 2～3次,使凝乳时间在 5 h左右。将 1%试管脱脂乳菌液分别接种于试管大豆乳培养基中,37℃培养,活化 2～3次,使干酪乳杆菌在大豆乳培养基中的凝乳时间达到 4.5～5.5 h,制成试管活化菌种。将1%试管大豆乳菌液接种于 100～300 mL三角瓶大豆乳培养基中,37℃培养,干酪乳杆菌在大豆乳培养基中在 4～4.5 h凝乳后即为单菌母发酵剂。

1.3.2 工艺流程与技术路线

1.3.2.1 豆乳发酵培养基的制备

选豆(挑选表面光泽无霉烂变质的大豆)→蒸馏水浸泡(豆与蒸馏水比例为 1∶10,25℃浸泡 12 h或至大豆饱和为止,含水量 65%左右)→碱水浸泡 (用0.25%的NaHCO3溶液浸泡 2h)→磨浆去渣→煮沸(豆浆 100℃,10 min煮沸)→调配(用 0.1%的 HCl调节至 pH 7.0)→均质 (10 min)→杀菌 (100℃,10 min)→冷却(至接种温度 37℃左右)大豆乳发酵培养基(大豆乳中固形物、蛋白质、脂肪、总糖质量分数分别为 10.3%、3.3%、2.5%、2.9%)。

1.3.2.2 干酪乳杆菌纯种发酵大豆乳工艺研究

对研制的大豆乳发酵培养基进行接种与发酵(在研究接种量、发酵温度、发酵起始 pH值、有氧或无氧发酵方式等单因素对酸豆乳发酵与感官风味影响的基础上,利用正交试验优化干酪乳杆菌纯种发酵大豆乳的工艺条件),把发酵终止后的大豆酸乳放入 4℃冰箱,12 h后熟,制成干酪乳杆菌发酵酸豆乳产品。

1.3.3 测定方法

1.3.3.1 感观指标

色泽、组织状态:取适量样品置于洁净烧杯中,在自然光下观察色泽和组织状态。滋味和气味:先闻气味,然后用温开水漱口,通过品尝确定样品滋味和气味。

1.3.3.2 活菌计数

平皿菌落计数法[6]:37℃有氧培养 36～48 h; Hungate厌氧滚管计数法[7],37℃厌氧培养 36～48h。

湖北作为中国南方长江流域的一个省份，应该为有这样一处与兵马俑、半坡村齐名的大冶铜绿山古铜矿遗址而骄傲。兵马俑、半坡村遗址是黄河文明的产物，而铜绿山古铜矿遗址是长江文明的产物。二者齐头并进，形成华夏文明的源头。

1.3.3.3 pH值测定

PHS-3C酸度计直接测定。

1.3.3.4 总酸测定

0.1 mol/L NaOH标准溶液滴定[8]。

1.3.3.5 统计分析方法

每个试验均重复三次,试验结果利用 SPSS软件进行方差分析即 F检验处理间差异显著性 (F= MSA/MSe),然后在方差分析处理间差异显著性基础上,用最小极差法即邓肯氏新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 干酪乳杆菌纯种发酵大豆乳工艺研究

2.1.1 接菌量对发酵的影响

根据 1.3.2.1技术路线,添加 20%的牛乳,7%蔗糖制成发酵培养基;采用干酪乳杆菌纯种发酵剂以接种量 3%、5%、7%(活菌数分别约为 3×107、5× 107、7×107cfu/mL)分别接种上述培养基,37℃有氧发酵,记录凝乳时间,检测凝乳活菌数、pH值及滴定酸度,评价发酵产品的感官风味,结果见表 1。

对表 1结果进行方差分析显示:分别以接种量3%、5%、7%接种发酵的大豆乳,凝乳时间差异极显著(P<0.01),凝乳时活菌数、pH值、滴定酸度均差异不显著(P>0.05)。发酵产品均凝乳坚实,质地细腻,有发酵豆香,酸甜适口。结果说明,接种量对发酵大豆乳的凝乳时间影响极显著,对凝乳时活菌数、pH值、滴定酸度影响不显著。所以,可将接种量定为下一步正交试验的备选因素。

表 1 接菌量对干酪乳杆菌 05-20纯种发酵及感观风味的影响

2.1.2 起始 pH值对发酵的影响

根据 1.3.2.1技术路线,添加 20%牛乳,7%蔗糖,pH值分别调至 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0制成发酵培养基;干酪乳杆菌纯种发酵剂接种量 5%,接种上述发酵培养基,37℃有氧发酵,记录凝乳时间,检测凝乳活菌数、pH值及滴定酸度,评价发酵产品的感官风味,结果见表 2。

表 2 起始 pH值对干酪乳杆菌 05-20纯种发酵及感观风味的影响

由表 2可见,基质起始 pH值为 6.0时,发酵产品产生明显分层现象;基质起始 pH值 8.0时,培养基灭菌后颜色变黄,并且在发酵过程中产生分层现象,所以未进行指标检测。对表 5结果进行方差分析显示:发酵大豆乳凝乳时间差异极显著 (P< 0.01)。起始 pH值分别为 6.5、7.0发酵豆乳凝乳时活菌数、pH值、滴定酸度均差异不显著 (P>0.05),但是分别与起始 pH值 7.5发酵豆乳凝乳时的对应试验结果差异显著(P<0.05)。起始pH值 7.0发酵的豆乳产品凝乳坚实,有发酵豆香,酸甜适中;起始pH值 6.5、7.5发酵豆乳在发酵过程中略有水析出,有发酵豆香。因此,基质起始 pH可定为下一步正交试验的备选因素。

2.1.3 温度对发酵的影响

根据 1.3.2.1技术路线,添加 20%牛乳,7%蔗糖,pH值 7.0制成发酵培养基;采用干酪乳杆菌纯种发酵剂接种量 5%,接种上述发酵培养基,分别在不同温度 35、37、39、41℃有氧发酵,记录凝乳时间,检测凝乳活菌数、pH值及滴定酸度,评价发酵产品的感官风味,结果见表 3。

表 3 温度对干酪乳杆菌 05-20纯种发酵及感观风味的影响

对表 3结果进行方差分析显示:试验菌株分别以35、37、39、41℃有氧发酵大豆乳,凝乳时间差异极显著(P<0.01),凝乳时活菌数、滴定酸度、pH值差异均不显著(P>0.05)。发酵产品均色泽乳白,凝乳坚实,具有发酵豆香,酸甜适中。所以,将发酵温度作为下一步正交试验的备选因素。

2.1.4 氧对发酵的影响

根据 1.3.2.1技术路线,添加 20%牛乳,7%蔗糖,pH值 7.0制成发酵培养基;采用干酪乳杆菌纯种发酵剂接种量 5%,接种上述发酵培养基,分别进行37℃厌氧和好氧发酵,记录凝乳时间,检测凝乳时活菌数、pH值及滴定酸度,评价发酵产品的感官风味,结果见表4。

表 4 厌氧和好氧发酵对干酪乳杆菌 05-20纯种发酵及感观风味的影响

对表 4试验结果进行 t检测分析得出:试验菌株在大豆乳中分别厌氧和好氧发酵方式所得各项检测指标结果之间均不显著(P>0.05);而且发酵产品凝乳坚实,有发酵豆香,酸甜适口。表明:采用干酪乳杆菌好氧发酵大豆乳工艺是可行的。在实际发酵生产中,采用好氧发酵可以简化生产工艺,降低生产成本。因此,后续试验均采用好氧发酵方式。

2.2 利用正交实验优化干酪乳杆菌纯种发酵酸豆奶大豆乳的工艺条件

由上述单因素试验选择出三个因素及每个因素的三个水平,见表 5。

表 5 正交试验因素水平表

采用三因素三水平 (L933)正交试验发酵大豆乳,以凝乳时产品中的活菌数为试验指标,加以考察各因素不同水平的凝乳时间及感官评价,综合试验确定出干酪乳杆菌发酵酸豆奶的最佳工艺,正交结果见表6。

表 6 干酪乳杆菌纯种发酵大豆乳工艺条件优化正交试验结果

表 6结果表明,在接种量 (A),发酵温度 (B),起始 pH值(C)三因素中,对干酪乳杆菌发酵大豆乳中活菌数指标的影响顺序为:起始 pH值 >接种量 =发酵温度,并确定干酪乳杆菌纯种发酵大豆乳的最适工艺组合为:A3B1C2,即在含有 20%牛乳和 7%蔗糖的大豆乳培养基中,总接种量 7%(活菌数约为7×107cfu/mL),基质起始 pH值 7.0,发酵温度37℃,有氧条件发酵;采用最适工艺条件进行干酪乳杆菌纯种发酵大豆乳的验证性试验,结果表明,凝乳时间为 5 h,发酵产品的总益生菌活菌数为 2.3×109cfu/mL、pH值为 4.5左右,滴定酸度 80.2°T,呈乳白色,凝乳坚实,质地细腻,有发酵豆香。

3 讨论与结论

随着大豆功能性研究的深入和人们健康意识的提高,积极研制并开发多功能大豆乳制品将成为豆制品行业竞争的热点和大众的消费时尚。

Scalabrini等[9]和 Kamaly[10]采用双歧杆菌发酵豆奶,双歧杆菌是严格厌氧菌,操作要求严格,不利于工业生产。而本试验所用干酪乳杆菌为兼性厌氧菌,可采用好氧方式发酵大豆乳。朱玉昌等[11]研究者采用短乳杆菌和嗜酸乳杆菌混菌发酵豆乳,凝乳需发酵 24 h。本试验所用菌种发酵大豆乳凝乳仅需5 h,发酵凝乳时间缩短,可缩短发酵周期,提高设备利用率。本研究通过正交试验确定了干酪乳杆菌发酵大豆乳最适工艺条件:在含有20%牛乳和7%蔗糖的大豆乳培养基中,基质起始 pH值 7.0,接种量7%,通过 37℃有氧发酵制得大豆酸乳,其凝乳时间为 5 h,凝乳时益生菌总活菌数 2.3×109cfu/mL,pH值 4.5,滴定酸度 80.2°T。所研制发酵产品具有浓郁的豆香和发酵香气,干酪乳杆菌发酵大豆乳产生的香气掩盖了豆乳中原有的豆腥味。关于干酪乳杆菌的产风味物质特性和后酸化特性正在深入研究之中。

试验研制的干酪乳杆菌纯种发酵酸豆奶综合了益生菌、大豆乳两方面的功能于一身,具有广阔的市场前景,而且为工业化生产干酪乳杆菌纯种发酵大豆酸乳产品及其推广应用提供了科学依据,同时为研制和开发其它多功能益生菌豆乳制品提供了新的思路和方法。

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Technology of SoybeanMilk Fermentation by UsingLactobacillus casei

Wang Jia Tian Hongtao Han Pu Zhang Lifang Cai Yi
(Food Science and Technology College,AgriculturalUniversity of Hebei,Baoding 071001)

Lactobacillus caseiisolated from dairy products and named as05-20 was taken as experi ment strain, which was oxygen-resistant,adversity-resistant and highly active.The fermentation conditions were studied.Re2 sults:The proper fer mentation conditions formaking satisfying soybean milk with addition of sugar 7%and milk 20% are ratio of soybean to water 1∶10(m/v),inoculum size 7%(7×107cfu/mL),initial pH 7.0,fermentation tem2 perature 37℃,and fer mentation time 5 h.The produced soybean milk has viable cell number more than 2.3×109cfu/ml,pH 4.5,acidity 80.2°T,and with milk white color,good curd property,good taste and full flavor.

Lactobacillus casei,fer mentation,soybean milk,technology

TS201.3 文献标识码:A 文章编号:1003-0174(2010)05-0085-05

河北省重大科技攻关专项(03220171D)

2009-04-19

王佳,男,1983年出生,硕士,益生乳酸菌及资源开发研究

田洪涛,男,1963年出生,教授,硕士生导师,食品微生物及发酵工程