蔗糖对酶法改性甜菊糖的影响研究

邵佩霞

(华南理工大学轻工与食品学院,广东广州 510640)

蔗糖对酶法改性甜菊糖的影响研究

邵佩霞

(华南理工大学轻工与食品学院,广东广州 510640)

用节杆菌产β-呋喃果糖苷酶催化转果糖基作用,对甜菊糖进行分子改性。采用蔗糖和甜菊糖的混合反应体系,考察了不同浓度蔗糖对甜菊糖转化率的影响,并比较了间歇式补加固体蔗糖和连续流加蔗糖溶液对甜菊糖转化率的影响,对反应条件进行了优化。优化条件下,采用初始浓度为 20%(W/V)的蔗糖反应,反应过程流加 30%(W/V)蔗糖溶液,反应 5h后,甜菊双糖A苷和甜菊苷的转化率均超过 90%,反应过程中二者的最高转化率均可达 98.6%。

甜菊糖,蔗糖,β-呋喃果糖苷酶,改性

图1 St、RA的结构及组成

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

β-呋喃果糖苷酶 利用节杆菌在适宜的培养条件下自制;甜菊糖 黑龙江省海林农场甜菊糖甙厂,含 RA28%,St55%;蔗糖 广州化学试剂厂,分析纯;葡萄糖 上海伯奥生物科技有限公司,分析纯;乙腈D IMA TECHNOLOGY INC.,色谱纯。

UV-2100紫外可见分光光度计 广州市正一科技有限公司;BT100-1J型蠕动泵 保定兰格恒流泵有限公司;恒温气浴摇床 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;高效液相色谱仪 Waters,美国。

1.2 实验方法

1.2.1 β-呋喃果糖苷酶活力的测定 用磷酸盐缓冲液(50mmol/L,pH6.5)配制浓度为 25%(W/V)的蔗糖溶液。取蔗糖溶液 2mL,置于 40℃恒温水浴中保温 10min,然后加入β-呋喃果糖苷酶粉 0.01g,置于40℃摇床 200r/min下反应 20min,然后将样品置于100℃水中 10min以终止反应。样品通过 0.22μm微孔滤膜过滤后,用高效液相色谱 (HPLC)检测各组分,外标法计算葡萄糖的含量。一个酶活力单位定义为：在上述条件下每分钟产生 1μmol葡萄糖所需的酶量。

1.2.2 甜菊糖的酶法改性研究

1.2.2.1 不同摩尔浓度蔗糖对甜菊糖转化率的影响

用磷酸盐缓冲液(50mmol/L,pH6.5)分别配制不同摩尔浓度的蔗糖与 1%(w/v)甜菊糖混合液,反应液体积为 200mL,加入 FFase 15U/mL,置于 35℃摇床200r/min下反应。不同时间取样,样品置于 100℃水中 10min以终止反应,考察不同浓度蔗糖对甜菊糖转化率的影响。

1.2.2.2 间歇式补加固体蔗糖对甜菊糖转化率的影响 设计3因素4水平的正交实验,考察在反应过程中间歇式补加固体蔗糖对甜菊糖转化率的影响。反应 3h后第一次补加,5h后第二次补加,7h后第三次补加,9h后第四次补加。反应条件同 1.2.2.1,实验因素与水平见表1。

表1 实验因素与水平表

1.2.2.3 连续流加蔗糖溶液对甜菊糖转化率的影响用磷酸盐缓冲液 (50mmol/L,pH6.5)配制 20% (w/v)蔗糖与 1%(w/v)甜菊糖混合液,反应液初始体积为 50mL,加入 FFase 150U/mL。反应过程中分别向反应体系流加 20%～50%(w/v)蔗糖溶液 50mL/h,其余反应条件同 1.2.2.1,考察连续流加蔗糖溶液对甜菊糖转化率的影响。

1.2.3 酶法改性甜菊糖的色谱分析条件 样品通过0.22μm微孔滤膜过滤后,用 HPLC检测改性结果,用峰面积归一化法计算甜菊糖的转化率。色谱系统：Separations Module(Waters 2695),Photodiode Array Detector(Waters 2998);色谱柱：SunFireTMC18φ5μm, 4.6×250mm;梯度洗脱：流动相为乙腈-水 (28∶72)至乙腈-水 (47∶53),流速 0.8mL/min,洗脱时间 20min;检测波长 213nm,检测器温度 30℃,柱温 30℃,进样体积10μL。

2 结果与讨论

2.1 酶法改性甜菊糖的 HPLC测定

按 1.2.3所述实验条件对产物 RA-F、St-F和反应物 RA、St进行分析,结果如图 2所示。

图2 酶法改性甜菊糖的HPLC图

由图 2可知,采用梯度洗脱对反应液物质进行分离,与等度洗脱相比大大缩短了分离时间,在此条件下各反应底物及产物均达到良好的分离效果,是一种高效灵敏的分离检测方法。

2.2 不同摩尔浓度蔗糖对甜菊糖转化率的影响

在蔗糖为底物的酶催化体系中,蔗糖在低浓度(5～20g/L)时,FFase催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖并生成极少量的低聚果糖,主要表现为水解活力;在高浓度 (200～700g/L)时,产物主要为低聚果糖,主要表现为转移活力;蔗糖浓度处于 5～20g/L和 200～700g/L之间时,FFase呈现出两种酶活[5-8]。底物蔗糖浓度对 FFase的酶活有重要影响,在甜菊糖的酶法改性中,主要利用 FFase的转移活力,因此本研究考察了 RA和 St在 0.25～2mol/L浓度蔗糖中的转化率,以确定甜菊糖酶法改性的较优条件,结果如图 3所示。

图3 蔗糖浓度对RA和 St转化率的影响

由图 3可看出,蔗糖浓度对 RA和 St的转化率有显著影响,RA和 St转化率的变化趋势非常相似。蔗糖浓度在 0.25mol/L时,RA和 St的转化率很低且变化缓慢,反应 5h后转化率基本不再增长,最高转化率分别是 43.4%和 46.1%。原因是蔗糖浓度较低时,FFase主要表现为水解活力,抑制了 FFase催化的转果糖基作用,RA-F和 St-F的生成率大大降低。蔗糖浓度在 0.5～1mol/L时,在反应 5h前,RA和 St的转化率增长迅速,此范围内的蔗糖浓度对转化率影响不大;反应 5h后,RA和 St的转化率增长缓慢,且随着时间的延长,转化率出现一定程度的下降。原因是蔗糖在反应过程中不断被消耗,蔗糖浓度随之下降,FFase催化的水解作用使转移的果糖基从产物上脱落,导致产物量下降。蔗糖浓度在 1.5～2mol/L时,RA和 St的转化率持续增长,但增长缓慢,反应20h后转化率均达到 65%左右;而蔗糖浓度在0.75～1mol/L时,反应 7～9h后 RA和 St的转化率即可达到 65%左右。原因是 FFase的最佳反应温度在30～40℃,本研究采用 35℃,在此温度条件下,高浓度蔗糖使反应液变得很粘稠,反应传质能力大大降低,反应速率下降。因此,综合考虑,选取最佳的蔗糖浓度为 0.5～1mol/L,即 17.1%(w/v)～34.2%(w/v),为方便起见,蔗糖浓度用质量-体积百分浓度表示,下同。

表2 正交实验直观分析表

2.3 间歇式补加固体蔗糖对甜菊糖转化率的影响

随着反应过程中底物蔗糖的消耗,甜菊糖的转化率达到最高点后由于水解作用开始缓慢下降,补加蔗糖可以继续提高甜菊糖的转化率。本研究通过蔗糖初始浓度、蔗糖补加量、蔗糖补加次数的 3因素4水平正交实验,考察反应 20h后 RA和 St的转化率,探索通过补加蔗糖提高甜菊糖转化率的优化条件,结果如表 2所示。

由表 2可见,各列极差范围为 5.712～7.672,极差大小差别不大,可见各因素对甜菊糖的转化率都有一定影响且影响程度相当。根据直观分析,实验的理论最佳条件应为蔗糖初始浓度 30%、补加量0.15g/mL、补加次数 3次,此条件在正交表中并未出现,因此采用此条件进行验证实验,得到 RA和 St的转化率分别为 73.10%和 75.81%。而正交表实验中最优的条件为蔗糖初始浓度 20%、补加量 0.2g/mL、补加次数3次,此条件下反应20h后RA和 St的转化率分别为 73.80%和 76.18%,与理论最佳条件下的转化率相当,因此需要从降低底物成本和提高转化率综合考虑以确定最优条件。优化条件后 RA和 St的转化率比实验 1.2.2中的最高转化率提高了 10%左右,得到了较满意的结果。

2.4 连续流加蔗糖溶液对甜菊糖转化率的影响

在实验 1.2.3中,蔗糖以固体的形式补加,补加后蔗糖需要一定时间才能溶解并参与反应,又由于间歇式补加会导致反应体系不均匀而延缓甜菊糖的转化,因此转化率没有大幅上升。为探索继续提高甜菊糖转化率的方法,采用初始浓度为 20%的蔗糖反应,反应过程分别流加 20%～50%的蔗糖溶液,并与不流加蔗糖的情况进行比较。由于流加溶液过程中,反应体系的增大会导致酶浓度下降而降低反应速率,为缩短反应时间,该实验中初始酶浓度从实验1.2.2、1.2.3的 15U/mL增加至 150U/mL,探索此条件下甜菊糖转化率的变化,结果如图 4所示。

图 4 连续流加蔗糖溶液对RA和 St转化率的影响

由图 4可看出,不流加蔗糖溶液的情况下,由于反应过程中底物蔗糖不断被消耗导致蔗糖浓度下降,反应体系在低蔗糖浓度时的水解作用加剧,因此RA-F和 St-F的生成量急剧下降,反应 24h后 RA和 St的转化率分别只有 10.7%和 10.8%。而流加蔗糖溶液可显著提高甜菊糖的转化率,流加蔗糖浓度为 20%时,反应 12h后 RA和 St的转化率分别为88.4%和 90.9%,随着时间的延长,反应达到平衡,转化率变化不大。流加蔗糖浓度为 30%～50%时,在反应初期 (2h前),RA和 St的转化率随着流加浓度的增大而呈小幅下降;反应中后期,各流加浓度条件下的甜菊糖转化率极为接近,可见此时该范围内的流加蔗糖浓度对 RA和 St的转化率影响不大,反应 5h后,RA和 St的转化率均超过 90%,反应过程中 RA和 St的最高转化率均可达 98.6%。流加蔗糖反应液在常温下放置一周,RA和 St的转化率基本保持不变,反应产物稳定。综合考虑,采用初始浓度为 20%的蔗糖反应,反应过程中流加 30%的蔗糖溶液可大幅提高甜菊糖的转化率,实验结果令人满意。

3 结论

在磷酸盐缓冲液体系中,利用节杆菌产β-呋喃果糖苷酶催化甜菊糖与蔗糖进行转果糖基反应,对甜菊糖进行改性。主要通过考察底物蔗糖对甜菊糖改性的影响,考察了不同浓度蔗糖对甜菊糖转化率的影响,并比较了间歇式补加固体蔗糖和连续流加蔗糖溶液对甜菊糖转化率的影响,对反应条件进行了优化。最后采用初始浓度为 20%的蔗糖反应,反应过程流加 30%蔗糖溶液的方法,反应 5h后,RA和St的转化率均超过 90%,反应过程中 RA和 St的最高转化率均可达 98.6%。反应液在常温下放置一周,反应产物稳定。甜菊糖作为新型甜味剂具有优良的性质和巨大的开发价值,以上研究探讨了酶法转果糖基作用改性甜菊糖,显著提高了甜菊糖的转化率,为去除其后苦味提供了理论与应用基础。

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Effect of sucrose on steviosides by enzym atic modification

SHAO Pei-xia
(College ofLight Industry and Food Science,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China)

A rthrobac te r p roduc ingβ-fruc tofuranos idase was used form olecula rm od ifica tion of s tevios ides.Suc rose and s tevios ides m ixed reac tion sys tem was used and the reac tion cond itions we re op t im ized.In the op t im ized cond itions,we used the initia l concentra tion of20%(W/V)suc rose and continuous ly added30%(W/V)suc rose solution in the reac tion p rocess.The conve rs ion of rebaud ios ide A and s tevios ide was both ove r90%afte r5h,and the ir highes t conve rs ion was both98.6% in the reac tion p rocess.

s tevios ides;suc rose;β-fruc tofuranos idase;m olecula rm od ifica tion

TS201.2+3

A

1002-0306(2010)03-0187-04

甜菊糖甙简称甜菊糖 (Steviosides),是从菊科植物甜叶菊 (S tevia rebaudianaBertoni)叶中提取的高甜度、低热量的天然甜味剂,其甜度相当于蔗糖的200～350倍,热量是蔗糖的 1/200～1/300。其除了具有高甜度、低热量的特性外,还有一定药理作用,对糖尿病、肥胖症、心脏病和高血压有明显的药理作用和辅助疗效。甜菊糖是一种安全的食品甜味剂,已经被 FDA批准使用,国内外大量毒理学实验结果表明,甜菊糖无致畸、致突变、致癌性,是目前国内外公认的可替代蔗糖的理想的健康新糖源,是继甘蔗糖、甜菜糖之外第三种具有开发价值的天然甜味剂,被誉为“世界第三糖源”[1]。甜菊糖是 8种不同甜味成分的双萜糖苷混合物,其中两种主要成分甜菊苷(Stevioside,简称 St)和甜菊双糖 A苷 (Rebaudioside A,简称 RA)共占甜菊糖的 80%以上。二者均有一定的苦味和不愉快的后味,二者的结构式及组成见图 1[2-3]。这种后味及苦味限制了其更为广泛的工业应用。酶法技术改性甜菊糖是当今甜菊糖后苦味改善和脱除最快捷、最有效的方法。通过酶法改性在St和 RA中引入果糖基,果糖基以β-2,6糖苷键连接至 19-O-β-葡萄糖基的 6-OH上[4],得到的衍生物 St-F和 RA-F的甜味特性有较大改善。β-呋喃果糖苷酶(FFase,EC 3.2.1.26)不仅可以从各种β-D-呋喃果糖苷底物的非还原端释放β-果糖,还能用蔗糖作果糖基供体将果糖基转移给含有羟基的受体[5]。因此,FFase同时具有水解活力和转移活力,不同来源的 FFase对不同浓度蔗糖的两种酶活分布有所区别。本研究以蔗糖和甜菊糖为反应底物,利用节杆菌产 FFase催化的转果糖基作用对甜菊糖进行分子改性,主要探讨底物蔗糖对甜菊糖转化率的影响。

2009-04-21

邵佩霞(1985-),女,硕士研究生,研究方向：食品生物技术。