不周氮源对丙酮酸分批发酵的影响及动力学模型的建立

胡晓冰，杨生玉，林标声

(1.河南大学生命科学学院生物工程研究所，河南开封475001; 2.黄河水利职业技术学院环境与化学工程系，河南开封475001; 3.福建省龙岩学院生命科学学院，福建龙岩364012)

不周氮源对丙酮酸分批发酵的影响及动力学模型的建立

胡晓冰1，2，杨生玉1，*，林标声1，3

(1.河南大学生命科学学院生物工程研究所，河南开封475001; 2.黄河水利职业技术学院环境与化学工程系，河南开封475001; 3.福建省龙岩学院生命科学学院，福建龙岩364012)

有机氮蛋白胨和无机氮(NH4)2SO4及其不同浓度进行丙酮酸分批发酵，测定了菌体浓度、产物浓度和基质浓度三项指标，从而推导出细胞生长、产物生成和基质消耗的发酵动力学方程和数学模型，其模拟曲线与实验值较好地相吻合，为产业化设计和生产提供了可靠的保障。

丙酮酸，分批发酵，动力学

1 材料与方法

1.1 实验材料

光滑球拟酵母(T.glabrata)THD418 盐酸硫胺素、生物素、盐酸吡哚醇、烟酸等四种维生素的渗漏缺陷型菌株，河南大学生物工程实验室保存;斜面培养基 酵母抽提物10g，蛋白胨20g，Glc 20g，蒸馏水1000mL，琼脂2%;种子培养基 Glc 40g，蛋白胨5.00g，MgSO4·7H2O 0.30g，KH2PO41.00g，水1000mL，pH5.0;发酵培养基 Glc 106g，硫酸铵8g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 0.3g，CaCO340g，CaCl250mg，FeSO440mg，MnCl23mg，ZnCl 25mg，CuSO44mg，盐酸硫铵素0.0125mg，盐酸吡哆醇0.54mg，生物素0.022mg，烟酸9.7mg，水1000mL，pH5.0。

表1 两种氮源发酵结果

1.2 实验方法

1.2.1 发酵方法 从新鲜斜面上接一环菌入种子培养基(100mL/500mL)锥形瓶，在30℃，220r/min下培养24h，以10%接种量接入发酵罐。7L发酵罐装液量为4L，用5mol/L NaOH控制pH5.0，发酵温度控制30℃，通气量180～200L/h。

1.2.2 测定方法 发酵液生物量的测定采用光密度法;丙酮酸的测定采用硝酸铁化学比色法;残糖含量的测定采用DNS法。

2 结果与分析

2.1 以蛋白胨和(NH4)2SO4分别作为氮源的分批发酵过程

为了研究发酵培养基中氮的含量及其性质对菌体浓度、丙酮酸产量和葡萄糖消耗的影响，用(NH4)2SO4作为无机氮源，蛋白胨作为有机氮源。将发酵培养基中的(NH4)2SO4的浓度设定为6、8、10g/L(氮浓度分别1.272、1.696、2.12g/L)，对应实验批次表示B11，B12和B13;将发酵培养基中的蛋白胨的浓度设为 13、17、21g/L(氮浓度分别为 1.3、1.7、2.1g/L)，同样相应实验批次为B21，B22和B23。在7L发酵罐中进行分批发酵，实验结果见图1和表1。

图1 (a)(NH4)2SO4为氮源发酵结果

图1 (b) 蛋白胨为氮源发酵结果

由图1可以看出，细胞生长曲线0～16h为生长迟滞期，16～30h为指数生长期，细胞生长在32～40h达到稳定生长期，此后细胞生长量基本维持不变或增长缓慢，56h达到最大。在以(NH4)2SO4作为氮源时，随着其浓度的增加，光滑球拟酵母生物以较缓慢速率增加，菌体干重对(NH4)2SO4氮的平均得率为10.21g/g，但丙酮酸产量以较快的速率增加，丙酮酸产量对(NH4)2SO4的得率为36.26g/g;而以蛋白胨作为氮源时，随着其浓度的增加，光滑球拟酵母以较快的速率增加，菌体干重对蛋白胨的得率为11.52g/g，但丙酮酸产量对蛋白胨的得率仅为34.56g/g。由此可以看出，无论有机氮源蛋白胨，还是无机氮源(NH4)2SO4都存在一个最适浓度。在(NH4)2SO4浓度为8g/L时，丙酮酸对葡萄糖的实际转化率达到最高的65.4%，丙酮酸产量为68.7g/L;而当蛋白胨的浓度为17g/L时，丙酮酸对葡萄糖的实际转化率达到最高的60%，丙酮酸产量为61.5g/L。

2.2 动力学分析

2.2.1 菌体生长的动力学分析 描述菌体生长最常用的模型为Monod方程，它是基于以下假设建立的: a.菌体生长为均衡型非结构式生长，细胞成分只需要用一个参数即菌体浓度表示即可;b.培养基中只有一种底物是生长限制性底物，其它营养成分不影响微生物生长;c.将微生物生长视为简单反应，并假设菌体得率为常数，没有动态滞后。显然b、c不符合光滑球拟酵母发酵的特征，采用Monod方程有偏差。结合菌体生长的特性和多批次发酵结果，发现该菌在发酵过程中，在一定发酵条件下，菌体的生长有一最大浓度，Logistic方程可以很好地解释这一现象。Logistic模型是一个典型的S型曲线，能很好地反映分批发酵过程中因菌体浓度的增加对自身生长存在的抑制作用，能较好地拟合分批发酵过程的菌体生长规律。即:

对上式积分可得:

式中:μ为比生长速率，h－1;K为比生长速率系数;CX为菌体浓度，g/L;C∞为最大菌体浓度，g/L。

应用Origin7.0软件的非线性方程Slogistic3，按实验测定数据进行最优化拟合，如图2和图3所示，即光滑球拟酵母生长模型和动力学方程为:

a.无机氮:

图2 无机氮细胞生长动力学拟合图

b.有机氮:

图3 有机氮细胞生长动力学拟合图

由拟合曲线图可知，无机氮实验数据和曲线能够很好的吻合，且最大菌体浓度和比生长速率系数K最大相对误差均小于10%。由于初始接种量的问题，使得初始实验值和模拟值存在较大误差，即拟合方程中的b值。而有机氮拟合程度较差，应该是营养物质多，菌体生长不规律所致。

2.2.2 产物生成动力学分析 微生物产物形成过程非常复杂，为便于研究，Gaden根据产物生成速率与细胞生长速率之间的关系，将其分为三种类型:a.相关模型;b.部分相关模型;c.非相关模型。由图1可以看出，虽然丙酮酸是初级代谢产物，但是在实验中的产物生成曲线对照菌种生成曲线来看，丙酮酸生成与细胞生长属于部分偶联型，这是因为光滑球拟酵母是营养渗漏缺陷型，需要一段时间进行生物量的积累。因此选用b部分相关的Luedeking－Piret方程对丙酮酸的生成进行动力学分析:

对式(9)进行积分可得:

对式(10)代入数据计算可知，以(NH4)2SO4为氮源时:α1=2.60，β1=0.052h－1;以蛋白胨为氮源时: α2=5.22，β2=0.02h－1。由于 α2＞α1，说明以(NH4)2SO4为氮源时，发酵过程中丙酮酸合成与细胞生长之间耦联程度要比蛋白胨为氮源时小一些。这主要是蛋白胨对于菌体浓度的影响要超过(NH4)2SO4，则:

无机氮丙酮酸生成动力学方程:

有机氮丙酮酸生成动力学方程:

式中:Cp为丙酮酸浓度，g/L;α为与生长相关联的丙酮酸形成系数，g/g;β为非生长相关联的丙酮酸形成系数，h－1。

为了验证以上动力学分析的有效性，利用已知数据带入方程来进行丙酮酸产量时间的拟合，结果见图4和图5。

图4 无机氮丙酮酸生成动力学拟合图

图5 有机氮丙酮酸生成动力学拟合图

由图4和图5可知，无机氮(NH4)2SO4的丙酮酸产量与时间的拟合图拟合程度较好，而有机氮蛋白胨的丙酮酸产量与时间的拟合图拟合程度并不是十分理想。原因是有机氮的产物生成与细胞浓度的关系较大，而在推导的过程中层层引入误差的缘故。但是从整体变化趋势上来看，有机氮和无机氮的产物—时间拟合图都能够反映出连续的产物生成，其动力学方程也表现出较好的实际意义。

2.2.3 葡萄糖消耗动力学分析 根据物料平衡，基质消耗通常分为三部分，即用于菌体的生长、产物的消耗和细胞内源维持的消耗。用微分方程表示的动力学模型:

将式(9)代入式(13)并化简得:

将数据代入式(14)可得到葡萄糖消耗动力学方程。

无机氮的基质消耗动力学方程:

有机氮的基质消耗动力学方程:

式中:CS为葡萄糖浓度，g/L;YP/S为丙酮酸的最大收率系数，g/g;YX/S为酵母的最大收率系数，g/g;γ为维持系数，h－1。

为了验证以上动力学分析的有效性，利用已知数据带入式(14)来进行丙酮酸产量时间的拟合。结果见图6和图7。

图6 无机氮葡萄糖消耗动力学拟合图

图7 有机氮葡萄糖消耗动力学拟合图

由图6和图7可知，无论有机氮还是无机氮，动力学方程拟合程度都不是很出色，无机氮比有机氮拟合效果好一些，能够描述基质消耗的规律。

3 讨论

所有酵母均能利用无机铵盐，但是在以无机铵盐为氮源的合成培养基上，目的产物的产出能力有很大差异。T.glabrata THD418在以硫酸铵为唯一氮源下能够产生大量丙酮酸;而在复合蛋白胨培养基中，产酸能力有所下降。究其原因主要是蛋白胨中因纯度不够而含有维生素含量少，酵母膏中含有的各种维生素的量较多。T.glabrata THD418是维生素的渗漏型，培养基中维生素含量过高增大了丙酮酸向TCA循环以及其他支路的通量，导致丙酮酸积累减少［11］。

由动力学方程拟合图可知，无机氮的三个动力学方程的拟合度要高于有机氮。细胞生成动力学、产物生成动力学方程拟合度要好于基质消耗动力学方程。对于微生物来讲，其整个反应过程既包括细胞内的生化反应，也包括胞内与胞外的物质交换，还包括胞外的物质传递过程。要对这样一个复杂的体系进行精确地描述几乎是不可能的。特别是在分批发酵过程中建立机制模型几乎是不可能［12－13］。为了工程上的应用，首先要进行合理的简化，即在细胞的生长过程中，细胞内各种成分均以相同的比例增加，视菌体为单组分，不考虑环境对菌体组成的影响。目前，国内外生化研究所构建的模型大多属于数学拟合模型和正规模型，数学拟合模型应用最为广泛。这些模型从本质上讲是对分批发酵过程总体现象和行为的描述，是一种现象模型。从工程角度出发，建立模型是为了更深刻地了解微生物复杂的反应本质，即是在于使用模型，建立最优的操作条件，并为反应器的优化和控制服务。一个好的现象模型必须具备两个特征:a.模型能够定量地描述发酵过程的变化;b.主要影响因子的作用能够在模型中反映出来［14］。本研究所建立的动力学模型基本具备以上两个特征，能较好地描述光滑球拟酵母THD418发酵过程的变化，特别是细胞生长模型和产物生成动力学模型，但基质消耗的动力学方程的模型预测值与实验值有一定的偏离，这可能是由多种原因造成的，如基质的组成成分、基质对产物的抑制作用、菌体的自溶和不利的外界条件等对产物生成的影响等。因此，需要在以后的研究中根据基质对产物的抑制作用、基质的消耗规律不断去修正所建立的动力学模型。

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Effect of different nitrogen forms on fermentation of pyruvate in batch process and kinetic modeling

HU Xiao－bing1，2，YANG Sheng－yu1，*，LIN Biao－sheng1，3
(1.Bioengineering Institute＆College of Life Science，Henan University，Kaifeng 475001，China; 2.Department of Enviroment and Chemistry Engineering，Yellow River Conservancy Technical Institute，Kaifeng 475001，China; 3.College of Life Science of Longyan University，Longyan 364012，China)

The effects of two different nitrogen sources，peptone and(NH4)2SO4on the growth of pyruvate production in batch fermentations were investigated.During fermentation of pyruvate，the measurement of cell concentration，pyruvate concentration and glucose concentration were taken.Based on the indexes above，kinetic equations and mathematical modes of cell growth，pyruvate production and substrate consumption were proposed.The simulation curve coincideed well with experiment values，which would offer assurance for the industrial design and production of pyruvate.

pyruvate;batch fermentation;kinetic

TS201.3

A

1002－0306(2010)08－0160－05

微生物反应是非常复杂的反应过程:在整个反应体系中有细胞的生长、基质的消耗和产物的生成，并且有各自的最佳反应条件;微生物反应有多种代谢途径，微生物反应过程中，细胞形态和组成要经历生长、繁殖、维持、死亡等若干阶段，不同菌龄有不同的活性。而微生物动力学就是研究各种发酵过程变量在活细胞中变化的规律，以及各种发酵条件对这些变量变化速度的影响。通过动力学的分析，更加深入地认识和掌握发酵过程，为工业发酵的模拟、优化和控制打下基础。其研究方法就是以数学模型定量描述发酵过程中细胞生长速率、基质利用速率和产物生成速率等因素的变化。近年来，丙酮酸作为一种重要的食品添加剂和酸味剂，特别是在减肥食品中的应用，使得其研究生产成为热点。而微生物法发酵丙酮酸的研究已经较为深入，各个因素对于丙酮酸发酵影响屡见报道［1－8］。但是，对于氮源的种类及其浓度对丙酮酸发酵的动力学分析尚未进行深入探讨。本文分别以蛋白胨和(NH4)2SO4作为氮源［9］，研究它们对T.glabrata THD418产丙酮酸分批发酵的影响，并对发酵过程中的菌体浓度、丙酮酸生成和葡萄糖的消耗进行动力学分析［10］。

2009－05－08 *通讯联系人

胡晓冰(1981－)，男，硕士研究生，助教，研究方向:工业微生物育种及食品发酵。