纳米均相时间分辨荧光免疫法检测脱氧雪腐镰刀菌醇方法的建立

周 彬，高 雷，金 坚，陈 蕴，黄 飚，*，赵卫国

(1.江苏省原子医学研究所卫生部核医学重点实验室，江苏无锡214063; 2.江南大学医药学院，江苏无锡214063;3.博阳生物科技(上海)有限公司，上海200000)

纳米均相时间分辨荧光免疫法检测脱氧雪腐镰刀菌醇方法的建立

周 彬1，高 雷2，金 坚2，陈 蕴2，黄 飚1，*，赵卫国3

(1.江苏省原子医学研究所卫生部核医学重点实验室，江苏无锡214063; 2.江南大学医药学院，江苏无锡214063;3.博阳生物科技(上海)有限公司，上海200000)

目的:利用抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)多克隆抗体，采用纳米均相时间分辨荧光免疫法测定技术(AlphaLISA)建立间接竞争DON定量检测方法。方法:DON－BSA包被发光微粒，生物素化羊抗兔抗体与包被有链霉素的感光微粒共同构成检测试剂，优化检测条件并评价检测性能。结果:该方法的灵敏度为0.007ng/mL，检测范围为0.007～100ng/mL，批内批间变异系数均＜5%。不同样品添加回收实验:玉米、小麦、啤酒回收率分别为84%～110%、67%～100%、74%～100%。结论:DON－AlphaLISA是目前DON检测中最灵敏的方法之一，该分析方法稳定性好，可测范围宽，具有很好的应用前景。

脱氧雪腐镰刀烯醇，生物毒素，纳米均相时间分辨荧光免疫法(AlphaLISA)

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

DON人工抗原、抗DON多克隆抗体和DON标准品及DON酶免试剂盒 江苏省微生物研究所;牛血清白蛋白(BSA)Sigma公司;亲和层析纯化的生物素化羊抗兔IgG 洛阳华美生物工程公司;光激化学感光液、发光微粒、白色不透明微孔板、AlphaLISA检测仪 上海博阳生物科技有限公司;检测样品购于本地超市;其它试剂 均为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 DON标准品的配制 用样品稀释液(10mmol/L，pH7.4的PBS)稀释DON标准品，配制成0，0.01，0.1，1，10，100ng/mL的系列标准品。

1.2.2 间接竞争DON－AlphaLISA方法的建立

1.2.2.1 DON人工抗原包被发光微粒的制备 在离心管中加入1mg感光微粒，12.5μL 1%Tween－20，0.05mg DON－BSA抗原，10μL硼氢化氰钠，用0.1mol pH6.0的2－(N－吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液将体积补充至200μL，37℃避光反应48h。然后加入10μL 0.3mol pH5.0的羧甲氧基胺半盐酸盐(CMO)溶液封闭未结合位点，37℃避光孵育1h后离心，分离得到已连接DON－BSA的感光微粒，稀释后备用。

1.2.2.2 样品处理 称取谷物样品或其制品2g，加入10mL蒸馏水，充分振荡5min后，用微孔滤膜(直径为0.45μm)过滤，取1mL滤液用1mL蒸馏水稀释备用。啤酒样品用蒸馏水比例稀释后进行检测。谷物及其制品中DON含量(ng/g)=提取液中DON含量×10。啤酒样品中DON含量为测得值乘以相应的稀释倍数。

1.2.2.3 检测步骤 取白色微孔板若干，加入20μL/孔包被有DON－BSA的发光微粒，加入20μL/孔DON标准品或待测样品，然后加入20μL/孔的DON多克隆抗体，最后加入生物素化的羊抗兔抗体。充分混匀上述各种试剂，37℃温育，加入包被有链霉亲合素的感光微粒(100μg/mL)175μL，37℃温育。在AlphaLISA检测仪中检测每孔发光光子量，根据光信号的强度绘制标准曲线，由标准曲线计算待测样品DON的浓度，见图1。

图1 均相间接竞争DON－AlphaLISA检测原理

1.2.2.4 反应条件的优化 建立间接竞争 DONAlphaLISA方法，对DON人工抗原－发光微粒，DON多抗稀释度，生物素化－羊抗兔抗体稀释度予以选择，以达到最适的测定条件和节省测定费用。

a.DON抗原－发光微粒与DON多克隆抗体工作浓度的选择 取白色微孔板，用反应缓冲液将DON抗原－发光微粒作一系列稀释:1∶10，1∶100，1∶1000，1∶10000，每种浓度1条，最后2孔只加反应缓冲液以作空白对照。DON多克隆分别以1∶100，1∶500，1∶1000，1∶5000，1∶10000稀释，每个浓度2孔/条。按1.2.2.3步骤测定各稀释度的荧光计数，统计检测结果。

b.生物素化羊抗兔IgG稀释度的确定 按照已经确定的DON抗原－发光微粒与DON多克隆抗体工作浓度，取白色微孔板，第一条加入20μL DON抗原－发光微粒，20μL标准品稀释液(零浓度点)和20μL抗DON多克隆抗体，第二条加入20μL DON抗原－发光微粒，20μL标准品稀释液和20μL抗体稀释液(非特异结合，Nonspecific binding，NSB)。将生物素化羊抗兔 IgG用稀释液作1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶600、1∶800等比例稀释后分别加入上述板条中，20μL/孔，每个稀释度两孔。按1.2.2.3步骤测定各稀释度的荧光计数，以荧光计数为纵坐标，生物素化羊抗兔IgG稀释度为横坐标，绘制曲线。选择零点荧光计数高，NSB低的生物素化羊抗兔IgG稀释度作为工作浓度。

c.反应动力学考察 最适竞争反应温度、时间的确定:按已确定的试剂工作浓度分别加入到白色微孔板中，25℃或37℃条件下，分别温育10、15、30、45min，给予感光微粒充足的反应时间。其他步骤同1.2.2.3，测定不同温度以及竞争时间下的标准曲线变化趋势。连有链霉亲合素的感光微粒反应温度、时间的确定:按1.2.2.3操作，感光微粒反应以不同的温度:25、37℃温育，不同的时间:10、15、30、45min，测定零浓度点的荧光计数。

d.标准曲线的绘制 由AlphaLISA分析仪直接得到的是各剂量点对应的计数值(CPS)，通过origin软件对数据进行分析处理。

1.3 方法学考核

1.3.1 回收率 称取玉米、小麦样品或加有DON标准品的玉米、小麦样品2g，加入10mL蒸馏水，充分振荡5min，微孔滤膜(直径=0.45μm)过滤，取1mL滤液用PBS稀释备用。通过计算实测值与理论值比值得出回收率。添加不同量的DON标准品的啤酒样品，经比例稀释后直接检测。

1.3.2 方法学的比较 取啤酒样品若干份，采用DON－AlphaLISA和DON－ELISA进行对照实验。分别用DON－AlphaLISA、DON－ELISA两种不同的免疫检测法对16份啤酒和22份玉米样品进行分析，比较不同检测方法的检测结果关联性。

2 结果与讨论

2.1 DON抗原－发光微粒与DON多克隆抗体工作浓度的选择

标记DON－BSA以及标记成功后复合物反应浓度对建立标准曲线的灵敏度有着至关重要的影响作用。因此选择合适的稀释比例是整个实验成败的关键。在实验中深入探讨了连有发光微粒的DONBSA以及抗DON PcAb最佳工作浓度，结果见表1。

由表1可知，当连有发光微粒的DON－BSA稀释比为1∶10时，虽然可以得到较高的计数(接近或大于10000)，但是由于高浓度的发光微粒导致本底比较高(本底为256);当连有发光微粒的DON－BSA稀释比为1∶1000时，可以有效的降低本底(本底仅为38)，但数零点计数下降明显(最高计数为3493)。因此，选择经过适当比例稀释的DON抗原－发光微粒意义非同寻常，必须满足保证有效的计数，同时又可以节约成本和降低本底。根据上述要求，稀释比在1∶100左右较为适合。

选取适当的多抗浓度可以提高检测灵敏度。对照实验结果得出:多抗稀释比在1∶1000～1∶5000范围内比较适合，既满足了检测要求也节约了试剂用量。

表1 DON－BSA－发光微粒和抗DON PcAb工作浓度的选择(荧光计数(CPS))

2.2 生物素化羊抗兔IgG稀释度的确定

选择合适的生物素化羊抗兔IgG稀释度，既能保证有足够的量结合到第一抗体上，又要避免引起非特异计数(NSB)的增加。在间接竞争 DONAlphaLISA，进行第二步反应时，抗体稀释液将生物素化羊抗兔IgG稀释成不同的浓度，结果如图2。

图2 生物素化羊抗兔IgG稀释度的选择

由图2可知，当生物素化羊抗兔IgG的稀释比不断加大时，零浓度点的荧光计数以及NSB均在1∶100稀释后开始下降明显，而在1∶200稀释后，下降趋于平缓。生物素化羊抗兔IgG 1∶100稀释时，其零浓度点的荧光计数为1∶50的61.2%，NSB为1∶50的21.78%。所以，选择1∶100的生物素化羊抗兔IgG作为最佳稀释浓度。

2.3 不同温度下的竞争反应时间的确定

反应温度分别设在25、37℃，进行时间动力学的考核。25℃，给予充足的示踪反应时间(生物素与亲和素结合反应)，测定不同竞争时间下标准曲线，结果见图3。

图3 25℃，竞争反应时间对DON－AlphaLISA的影响

由图3可知随着反应时间的延长，各浓度点的荧光计数逐渐增大，但增幅各不相同，ED50所对应的浓度点随时间延长而减小，曲线灵敏度趋高。竞争反应时间30min与45min下的标准曲线，已无明显差异。因此，选择30min为最适竞争反应时间。

按照同样的方法，将反应温度设为37℃，绘制不同竞争时间下标准曲线。结果见图4。按照上述分析原理，此时15min的竞争反应时间已经得到灵敏度较高的标准曲线。因此，37℃反应温度下，15min为最适竞争反应时间。从节约时间成本的角度考虑，选择37℃，15min为DON－AlphaLISA竞争反应条件。

图4 37℃，竞争反应时间对DON－AlphaLISA的影响

2.4 连有链霉亲合素的感光微粒反应温度、时间的确定

生物素与亲和素可以在较短的时间内完成结合反应。在25℃条件下，不同示踪时间下的标准曲线的结果见图5。结果表明15～30min的反应时间基本能够完成生物素与亲和素结合反应。

图5 25℃，示踪时间对DON－AlphaLISA的影响

在37℃条件下，不同示踪时间下的标准曲线的结果见图6。反应时间为10min时生物素与亲和素的反应完成一半或许更多。当反应时间延长至15min已经基本完成反应。进一步延长反应时间对提高检测的灵敏度并无显著影响。因此，选择37℃，15min作为示踪反应时间即可。

2.5 DON－AlphaLISA标准曲线的绘制

综合各项优化的结果，间接竞争 DONAlphaLISA的最适检测条件为:DON人工抗原－发光微粒稀释度1∶100;抗DON PcAb稀释度1∶3000;生物素化羊抗兔IgG的稀释度1∶100;两步温育的温度与时间分别是37℃ 15min和37℃ 15min。间接竞争DON－AlphaLISA的结果经orgin软件处理所得的标准曲线，见图7。

图6 37℃，示踪时间对DON－AlphaLISA的影响

图7 均相间接竞争DON－AlphaLISA标准曲线

以10组标准曲线零浓度点计数的平均值(¯X)和标准差(SD)，以¯X的计数减2倍SD所得的计数从标准曲线中找到对应浓度及方法的检测灵敏度。间接竞争DON－AlphaLISA的灵敏度为0.007ng/mL，检测范围为0.007～100ng/mL，IC50为4.84ng/mL。

2.6 添加回收率实验

已知浓度的DON添加到各样品中，采用均相间接竞争DON－AlphaLISA方法检测，各个浓度的检测结果见表2。从表2可以看到，平行孔间的CV相对较小，这可能是由于均相检测的原因，减少人为操作误差导致的批内变异。这一结果充分说明了检测稳定性较好。整个样品添加回收率偏低，这可能是样品处理过程中损失造成的。除了个别样品，大部分也还在可接受范围内(＜±20%)。

表2 添加回收率测定结果

2.7 方法学比较

2.7.1 DON－AlphaLISA和DON－ELISA检测啤酒和玉米样品的比较 用本实验室建立的DONAlphaLISA和DON－ELISA同时检测16份啤酒样品，对两种方法的检测结果进行线性回归分析，结果如图8所示。其 Y=1.05910X－0.5185，相关系数为0.9525，表明两种检测方法的相关性很好。由结果观察测得值在较低浓度范围内(＜10ng/mL)，DONAlphaLISA测得值略微高于DON－ELISA，而在高浓度范围内又呈现出相反的关系。导致这样的结果，可能是啤酒中存在某些干扰基质。

图8 不同免疫检测法检测啤酒样品的结果比较

采用本实验室建立的DON－AlphaLISA试剂盒和DON－ELISA试剂盒检测22份玉米样品，对两种方法的检测结果进行对照比较。结果如图9所示。其Y=0.0508+1.1591X，R=0.9167，其中两份样品由于DON含量低于DON－ELISA检测限，而DONAlphaLISA的检测值分别为0.075ng/mL和0.037ng/mL。表明两种检测方法的相关性很好且DON－AlphaLISA检测方法更灵敏。

图9 不同免疫检测法检测玉米样品的结果比较

3 结论

纳米均相时间分辨荧光(AlphaLISA)是由光激发产生的均相化学发光技术。它具有快速、均相(免冲洗)、高灵敏和操作简单的特点。AlphaLISA技术的核心原理是高能态离子氧的产生和传递。在受到红色激光(680nm)照射后，感光微粒能使周围环境中的氧转化为高能态离子氧，如果发光微粒在200nm范围之内就能接受离子氧，并发出高能级的光(520～620nm)。相反，如果在200nm直径范围内没有发光微粒，高能态离子氧就会回落到基态氧而没有信号产生［6－7］。

DON－AlphaLISA的测定基础是标记免疫反应。包被有发光微粒的DON－BSA加入微孔板，然后顺序加入DON标准或样品、抗DON PcAb、生物素化羊抗兔抗体避光反应，再加入包被有链霉亲和素的感光微粒孵育后检测。包被有发光微粒的DON－BSA与DON竞争连接到DON抗体，然后与生物素化羊抗兔IgG以及包被有链霉亲和素的感光微粒形成复合体，在特定条件下发光微粒将信号通过连接在一起的复合体传递给感光微粒产生化学发光，用化学发光检测仪检测光信号，光信号强度与样品中的DON浓度成反比，对照标准曲线即可确定被测样品中DON的含量。

我们建立了均相DON－AlphaLISA免疫检测法，均相间接竞争DON－AlphaLISA的最适检测条件为: DON人工抗原－发光微粒稀释度1∶100;抗 DON PcAb稀释度1∶3000;生物素化羊抗兔IgG的稀释度1∶100;两步温育的温度与时间均为 37℃15min。DON－AlphaLISA的灵敏度为0.007ng/mL，检测范围为0.007～100ng/mL。

DON－AlphaLISA两步共30min的反应模式大大缩短了检测时间，同时由于免清洗减少了人为误差，使得检测结果的稳定性非常好，批内、批间变异率＜5%。整个检测过程可以自动化，方便进行大批量检测。检测范围宽达到0.007～100ng/mL灵敏度和高达到0.007ng/mL。通常高的灵敏度检测法常常易受本底干扰。但是在本实验中并没有显现出明显的基质干扰现象(本底＜20计数)。DON－AlphaLISA另一大优势是节约试剂剂量，检测样本量较少仅为20μL/孔。添加回收率实验结果表明回收率均值在90%左右，同时CV值较小说明检测的稳定性较好。

［1］Wu F.Mycotoxins risk assessment for the purpose of setting International Regulatory Standards［J］.Environ Sci Technol，2004，38(15):4049－4055.

［2］GB/T 16369－2003.小麦、玉米中脱氧雪腐镰刀菌烯醇限量标准［S］.

［3］李群伟，侯海峰，李亚鲁，等.脱氧雪腐镰刀菌烯醇致家兔多脏器损伤的实验观察［J］.中国地方病防治杂志，2007，22 (1):19－22.

［4］Zhang X H，Xie T X，Li S S，et al.Contamination of fungi and mytoxins in foodstuffs in high risk area of esophageal cancer［J］. Biomed Environ Sci，1998，11(2):140－146.

［5］Vesely D，Vesela D.Embryo toxic effects of a combination zearale－none and vomitoxin(4－dioxynivalenone)on the chick embryl［J］.Vet Med Phaha，1995，40(9):279－281.

［6］Edwin F，Ullman，Hrair Kirakossian，et al.Luminescent oxygen channeling assay(LOCITM):sensitive，broadly applicable homogeneous immunoassay method［J］.Clinical Cbemistry，1996，42(9):1518－1526.

［7］Edwin F，Ullman，Hrair Kirakossian，et al.Luminescent oxygen channeling immunoassay:Measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence［J］.Biochemistry，1994，91(6): 5426－5430.

Quantitative determination of deoxynivalenol using light initiated chemiluminescence assay

ZHOU Bin1，GAO Lei2，JIN Jian2，CHEN Yun2，HUANG Biao1，*，ZHAO Wei－guo3
(1.Key Laboratory of Nuclear Medicine，Ministry of Health PRC，Jiangsu Institute of Nuclear Medicine of Jiangsu province，Wuxi 214063，China;2.School of Medicine and Pharmaceutics，Jiangnan University，Wuxi 214063，China; 3.Shanghai Boyang Biotechnology Company Ltd.，Shanghai 200000，China)

Objective:An indirect competitive light initiated homogeneous time－resolved fluoroimmunoassay (AlphaLISA)was established by using anti－DON polyclonal antibody and coating antigen DON－BSA for detection of deoxyhivalenol in cereal.Method:DON－BSA was coated on chenilum inescent particles，the AlphaLISA kit also contained sensitizer particles coated with strep tavidin.The optinal test conditions and analytical performance of the method were studied.Results:Working concentration range from 0.007 to 100ng/mL and the sensitivity for detection was 0.007ng/mL.The intra－and inter－assay CV of the assay were both below 5%.The recoveries of determination for deoxynivalenol spiked in corn，wheat，beer were 84%～110%、67%～100%、74%～100%.Conclusions:This AlphaLISA method is a good method with high sensitivity for quantitative analyzing DON in cereal.

deoxynivalenol;biotoxin;homogeneous time－resolved fluoroimmunoassay(AlphaLISA)

Q939.91

A

1002－0306(2010)08－0338－05

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)又称呕吐毒素，属于B型单端孢霉烯族毒素，主要由禾谷镰刀菌产生。目前，世界范围内DON对谷物的污染居各种生物毒素之首，呈较严重的状况，而长期暴露于高浓度的DON毒素可导致营养不良，表现不同水平的中毒症状，甚至死亡［1］。因此监控DON的含量显得意义重大。我国目前小麦、玉米中DON的限量为1000μg/kg［2］，而部分国家(如奥地利和欧盟等)的限量标准低于我国的限量标准。检测DON的方法有理化检测法和免疫化学法。前者主要包括薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)［3］。后者研究较多的是酶联免疫分析法(ELISA)［4－5］。ELISA检测法存在标记物酶易失活、底物见光易分解、环境干扰因素复杂等缺点，且已不能满足越来越低的限量标准。因此，本研究采用快速高灵敏的纳米均相时间分辨荧光免疫法(AlphaLISA)检测谷物及其制品中的DON含量。

2009－08－20 *通讯联系人

周彬(1981－)，男，研究实习员，研究方向:食品安全检测。

国家高技术研究发展计划(863)(2008AA10Z415);江南大学食品科学与技术国家重点实验室目标导向课题(SKLFMB－200801)。