高效液相色谱-质谱法同时测定川芎提取液中7种有效成分

刘 洁，余李敏，翟 帆

（陕西新药技术开发中心，陕西 西安 710075）

川芎(Rhizoma Chuanxiong)为伞形科植物川芎(Ligusticum chuanxiong Hort.)的干燥根茎，性温、味辛，具有活血行气、祛风止痛的功效，临床主要用于治疗月经不调、经闭痛经和头痛等症，是中医临床广泛应用的药材之一［1］。川芎中含有酚酸、生物碱、内酯和挥发油等多类有效成分，文献常用的测定方法包括液相色谱-紫外检测法、液相色谱-质谱法、毛细管电泳-紫外检测法和气相色谱-质谱法等。上述方法为川芎的质量控制作出了重要的贡献，且具有良好的应用前景。然而，如何建立一种川芎中多种有效成分同时测定的方法是值得探讨的问题。本文采用液相色谱-质谱同时测定川芎中7种有效成分的含量，旨在为川芎的综合质量控制做出贡献。

1 仪器与材料

仪器:Agilent 1100系列高效液相色谱-离子阱质谱联用系统(包括二元梯度泵，7725i手动进样器，DAD二极管阵列检测器，SL型电喷雾-离子阱质谱和Chmistation 5.2工作站)；Sartorius BP221s型电子分析天平(万分之一，美国Sartorius公司)。

材料:香草醛为分析纯；阿魏酸和盐酸川芎嗪对照品购自中国药品生物制品检定所(批号:110773-200612、110817-200305)；川芎内酯 I、川芎内酯 H、川芎内酯A和藁本内酯对照品为本实验室采用制备液相色谱制备，归一化法测定纯度均不低于96.0%；川芎药材(四川产)购于陕西省药材公司，并由陕西省药品检验所进行鉴定。

2 方法与结果

2.1 分析条件

2.1.1 色谱条件 色谱柱Agilent TC-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相A为0.2%的乙酸水溶液，B为甲醇，梯度洗脱设置为:30%B保持5.0 min，30 min内线性增加为80%B，保持5.0 min；柱温为25.0℃；流速:0.8 mL/min(柱后3:1分流，V∶V)。

2.1.2 质谱条件 电喷雾离子源正离子模式；喷雾电压3.5 kV；毛细管电压－3500 V，干燥气流速7.0 L/min；干燥气温度325℃；雾化气压力45 psi；雾化气温度350℃；质量扫描范围50～1000 amu。

2.2 对照品供试品溶液的制备

精密称取香草醛、阿魏酸、盐酸川芎嗪、川芎内酯I、川芎内酯H、川芎内酯A和藁本内酯对照品适量，加95%的甲醇配制成浓度分别为0.90，1.80，1.35，3.6，1.40，2.44 和2.10 mg/mL 的混合供试品溶液，4.0℃冷藏备用。

2.3 药材供试品溶液的制备

取干燥川芎药材，粉碎，过40目筛。精密称取5.0 g药材粉末，加入6倍量95%的甲醇水溶液，超声30.0 min，过滤，重复3次，合并滤液，95%的甲醇水溶液定溶于100.0 mL量瓶中，4.0℃冷藏备用。

2.4 线性关系

取2.2项下对照品溶液适量，加95%甲醇水溶液配制成系列供试品溶液，在拟定分析条件下，精密吸取10.0 μL进样，采用离子阱质谱的多级反应模式(MRM)进行分析，香草醛选择m/z 153.1为母离子，m/z 126.1为子离子；阿魏酸选择m/z 195.3为母离子，m/z 178.1为子离子；川芎嗪选择 m/z 137.2为母离子，m/z 122.3为子离子，川芎内酯 I选择m/z 225.1为母离子，m/z 208.2为子离子，川芎内酯H选择m/z 225.1为母离子，m/z 208.2为子离子，川芎内酯A选择m/z 105.1为母离子，m/z 147.9为子离子，藁本内酯选择m/z 191.2为母离子，m/z 148.1为子离子，采集提取离子流图，以各对照品提取离子峰峰面积对其浓度作图，得线性回归方程，计算线性范围，结果见表1。

表1 线性关系测定结果Tab.1 Results of calibration curve

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验 精密吸取2.3项下川芎供试品溶液20.0 μL，在拟定分析条件下，重复进样5次，分别测定香草醛等有效成分的含量，结果发现7种有效成分的相对标准偏差分别为1.12% ，0.94%，1.31%，1.20%，1.24%，0.97% 和0.82%(n=5)，表明该方法具有较好的精密度。

2.5.2 重复性试验 取川芎药材粉末适量，按2.3项下的样品制备方法平行制备药材供试品溶液5份，在拟定分析条件下，进样分析，计算7种有效成分的相对标准偏差分别为 0.96%，0.82%，1.231%，1.17%，0.94%，1.07%和0.91%(n=5)，表明该方法具有良好的重复性。

2.5.3 稳定性试验 取川芎药材供试品溶液，分别于室温放置0，4，8，12，24 h后依法测定7 种有效成分的含量，计算相对标准偏差分别为1.01%，0.87%，1.14%，1.05%，0.934%，1.07% 和0.76%(n=5)，表明样品在24 h内稳定性良好。

2.5.4 加样回收率试验 分别取香草醛等7种有效成分含量分别为 0.06，0.21，0.04，0.97，0.32，8.20和12.53 mg/g的川芎药材粉末约0.1 g，精密称定，分别准确加入0.5、1.0和2.0 mL混合对照品溶液，按2.3项的样品制备方法制备药材供试品溶液。拟定分析条件下，测定各有效成分的含量，计算回收率。结果发现7种有效成分的平均回收率分别为98.7%，101.2%，99.2%，98.4%，102.5%，101.6%和99.7%(n=6)，对应的相对标准偏差(RSD)分别为 1.2%、0.8%、0.5%、1.4%、0.6%、0.3%和0.7%，表明该方法回收率良好。

2.6 样品含量测定

精密称取川芎药材粉末3份，每份0.5 g，按2.3项下样品制备方法制备药材供试品溶液。精密吸取20.0 μL，拟定分析条件下进样分析，总离子流图见图1。重复3次，测得药材中7种有效成分含量的平均含量分别为:0.12，0.25，0.41，0.99，0.30，8.96和11.25 mg/g。

图1 川芎药材供试品溶液液相色谱-电喷雾质谱总离子流图1.香草醛 2.阿魏酸 3.川芎嗪 4.川芎内酯I5.川芎内酯H 6.川芎内酯A 7.藁本内酯Fig.1 Total ion current chromatogram of Ligusticum chuanxiong Hort.extraction1.Vanillin 2.Ferulaic acid 3.Ligustrazine 4.Senkyunolide I 5.Senkyunolide H 6.Senkyunolide A 7.Ligustilide

3 讨论

3.1 文献中有关川芎中有效成分含量测定的报道较多，常用的方法为高效液相紫外检测法。然而，该方法每次仅能对川芎中的某一类有效成分进行测定，且往往会因检测波长的不同导致方法灵敏度下降，使其在川芎多成分分析方面的应用受到限制。本文采用高效液相色谱-电喷雾质谱法测定了川芎中的7种有效成分，证明该法具有简便、快速和定性定量准确的特点，特别适合于药材的多成分分析和指纹图谱研究。

3.2 图1中保留时间为23.4 min的色谱峰分离良好且强度较大，质谱法测得其分子离子峰为m/z 357.4，与苯酞类化合物Coniferylferulate的质谱信息一致，但由于缺少相应的对照品，本文未能对该化合物进行准确定性和含量测定。

［1］中国药典［S］.一部.2005:28.

［2］韩 丽，黄媛莉，杨 明，等.川芎配方颗粒高效液相色谱指纹图谱研究［J］.时珍国医国药，2008，19(12):2924-2925.

［3］曹建敏，王棕华，孙广平，等.川芎中内酯类化学成分的提取与溶剂萃取分离方法研究［J］.分析试验室，2005，24(9):59-62.

［4］Jin Y U，Liang T U，Fu Qing，et al.Fingerprint analysis of Ligusticum chuanxiong using hydrophilic interaction chromatography and reversed-phase liquid chromatography［J］.J Chromatography A，2009，1216:2136-2141.