藏药材莲座蓟质量标准研究

陈 燕， 易进海*， 德 吉， 刘倩伶

（1.四川省中医药科学院，四川 成都 610041；2.西藏自治区藏医院，西藏 拉萨 850000）

莲座蓟为菊科植物莲座蓟Cirsium esculentum(Sievers)C.A.Mey.的全草。为藏、蒙族习用药材，具有散瘀消肿，排脓托毒，止血的功效，用于治疗肺脓肿，疮痈肿毒，皮肤病，肝热，各种出血［1-2］。主要分布在我国西藏、新疆、内蒙古和东北等地，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准·藏药》第一册和《内蒙古中草药》。目前尚无质量标准研究，其化学成分也未见报道。本实验对收集的4批莲座蓟药材化学成分进行了系统预试，采用3种不同的展开剂和流动相对药材进行了薄层鉴别及HPLC图谱的定位核对，发现莲座蓟药材中含有绿原酸、芦丁等化合物，据文献报道绿原酸、芦丁具有抗炎、抗变态、抗病毒、解热的作用［3-4］，与莲座蓟的功能主治相符。为此，参照《中国药典》2005年版一部天山雪莲项下的含量测定方法，采用HPLC法测定莲座蓟药材中绿原酸、芦丁的含量，为莲座蓟药材的质量评价提供参考方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

显微镜:日本奥林巴斯生物显微镜、尼康(NIKON)摄影显微镜，显微描绘仪:香港莱卡显微描绘仪、北京第三光学仪器厂显微描绘目镜。显微制图:采用显微描绘仪绘制，然后取其主要显微特征，组合成显微特征图版，最后采用硫酸纸描绘而成。Waters高效液相色谱仪:包括Waters1525泵，2487双通道紫外检测器，Waters柱温箱，Breeze液相色谱工作站。Brasson超声清洗仪。塞多利斯十万分之一电子天平。

1.2 试剂与样品

绿原酸、芦丁对照品(批号:110753- 200413；100080- 200306；中国药品生物制品检定所，含量测定用)。4批莲座蓟药材由西藏自治区藏医院提供，经四川省中医药科学院舒光明研究员鉴定为菊科植物莲座蓟Cirsiumesculentum(Sievers)C.A.Mey.的干燥全草。甲醇为美国Tedia色谱纯，水为超纯水，硅胶G(青岛海洋化工厂)，其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 显微鉴别

本品粉末绿褐色。用间苯三酚、浓盐酸染色，置显微镜下观察。结果可见，本品冠毛主轴由多细胞组成，直径36～78 μm；冠毛非腺毛细长，单细胞，直径22～39 μm，长至640 μm。苞片表皮细胞表面观呈长条形，直径10～27 μm，可见稀疏孔沟及斜纹孔。气孔位于叶表面，呈椭圆形，直径23～26 μm，不定细胞型。非腺毛由2～5个细胞组成，微弯曲，有的中部微溢缩状，直径11～18 μm。花粉粒淡黄棕色，类球形或阔椭圆形，直径46～55 μm，外壁具钝齿状突起及细网状雕纹，有的可见三萌发孔。导管网纹或螺纹，直径10～65 μm。见图1。

图1 莲座蓟药材显微特征图

2.2 薄层鉴别

取4批本品粗粉0.2 g，加甲醇2 mL，超声处理20 min，静置，上清液作为供试品溶液。另取芦丁对照品、绿原酸对照品，各加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取供试品溶液10 μL、对照品溶液5 μL，分别条状点于同一聚酰胺薄膜板上，以醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，待乙醇挥干后，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。见图2。

图2 莲座蓟药材TLC图谱

2.3 绿原酸、芦丁的含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱:Phenomenex Luna C18(2)(4.6 mm ×150 mm，5 μm)；柱温:30 ℃；流动相:甲醇－1%冰醋酸溶液(32∶68)；检测波长为340 nm；流速:1.0 mL/min。理论板数按芦丁峰计算应不低于8000。在此色谱条件下，绿原酸、芦丁对照品、莲座蓟药材的HPLC图谱见图3。

2.3.2 供试品溶液的制备 取本品粉末(过三号筛)约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50%甲醇25 mL，称定重量，超声处理(功率250 W，频率50 Hz)20 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液1 mL，置5 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

图3 莲座蓟药材HPLC图

2.3.3 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品5.34 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密称取绿原酸对照品8.51 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取芦丁对照品溶液1.0 mL和绿原酸对照品溶液1.0 mL，置同一10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液(每1 mL中含芦丁0.02136 mg和绿原酸0.03404 mg)。

2.3.4 线性关系 精密吸取绿原酸、芦丁对照品混合溶液 2、4、6、8、10 μL，注入液相色谱仪中测定。以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得绿原酸的回归方程为:Y=2978884.5X－6843，r=0.9997。芦丁的回归方程为:Y=4925938X －33651.8，r=0.9998。结果表明绿原酸在0.06808 ～0.3404 μg、芦丁在 0.04272 ～0.2136 μg范围内呈良好线性关系。

2.3.5 精密度实验 取2.3.3项下的对照品溶液5 μL，分别连续进样5次，依法测定峰面积，结果绿原酸和芦丁的RSD分别为0.83%、0.91%。表明仪器精密度良好。

2.3.6 稳定性实验 取2.3.2项下的供试品溶液(批号:01)，精密吸取 10 μL，分别于室温放置 0、1、2、4、6、24 h后注入液相色谱仪，依法测定峰面积，结果绿原酸和芦丁峰面积稳定，RSD分别为0.72%、0.88%，表明供试品溶液室温放置24 h内稳定。

2.3.7 重复性实验 取样品粉末(批号:01)5份，每份0.5 g，精密称定，照2.3.2项下方法分别制成供试品溶液，精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，依法测定峰面积，测得绿原酸和芦丁的含量分别为0.3452%和0.1536%，RSD分别为1.09%和1.14%。表明试验方法良好。

2.3.8 加样回收率实验 取已知绿原酸和芦丁含量的样品(批号:01)粉末6份，每份0.25 g，精密称定，准确加入一定量的绿原酸对照品(0.3404 mg/mL)2.5 mL、芦丁对照品(0.2136 mg/mL)2.0 mL，照含量测定项下操作，测定含量，计算回收率，绿原酸平均回收率为97.66%，RSD为1.06%；芦丁平均回收率为97.73%，RSD为1.14%。结果见表1。

表1 绿原酸和芦丁加样回收率测定结果(n=6)

2.3.9 样品含量测定 样品4批，分别依2.3.2项下方法制成供试品溶液，依法测定，绿原酸和芦丁含量测定结果见表2。

表2 莲座蓟药材中绿原酸和芦丁含量测定(n=3)

3 讨论

提取方法的选择 本试验对供试品溶液的不同提取方法(超声、回流)，不同提取溶剂(甲醇、50%乙醇)及不同提取时间(20、45 min)分别进行考察。结果50%乙醇25 mL超声提取20 min绿原酸和芦丁的含量均较高，杂质峰较少，该法简便，可控性强。

莲座蓟的薄层色谱鉴别 曾参照2005年版一部天山雪莲药材的TLC展开条件乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10 ∶6 ∶1 ∶2)的上层溶液为展开剂［5］，对样品进行薄层色谱鉴别，发现色谱斑点间分离度较差，经反复试验，采用聚酰胺薄膜板上，以醋酸为展开剂，展开效果较好，薄层色谱斑点清晰、明确。

曾比较研究流动相甲醇－0.4%磷酸(38∶62)和甲醇－1%冰醋酸溶液(32∶68)，结果发现磷酸对峰形影响较大，拖尾严重，采用醋酸可改善此现象。

莲座蓟作为藏、蒙族地区常用药材，其化学成分未见报道，本实验通过对该药材的显微鉴别、TLC及绿原酸和芦丁的含量测定的研究，初步建立了该药材的质量标准，结果显示该方法简便、准确、重现性好，可作为莲座蓟药材质量评价的参考方法。

［1］中华人民共和国卫生部药典委员会编.中华人民共和国卫生部药品标准藏药第一册［S］.1995:84.

［2］内蒙古自治区卫生局编.内蒙古中草药［M］.北京:内蒙古自治区人民出版社，1972:42.

［3］吴卫华，康 帧.绿原酸的药理学研究进展［J］.天然产物研究与开发，2006，18:691-694.

［4］藏志和，曹丽萍.芦丁药理作用及制剂的研究进展［J］.医药导报，2007，26(7):760-768.

［5］中国药典［S］.一部.2005:36.