响应面法优化白芍中芍药苷的超临界流体提取研究

汤磊，刘本

(1.浙江大学宁波理工学院生化分院，浙江宁波 315100;2.浙江大学材料与化学工程学院，浙江杭州 310027)

响应面法优化白芍中芍药苷的超临界流体提取研究

汤磊1，2，刘本1*

(1.浙江大学宁波理工学院生化分院，浙江宁波 315100;2.浙江大学材料与化学工程学院，浙江杭州 310027)

芍药苷;超临界流体提取;响应曲面分析法;优化提取条件

目的:研究芍药苷的最佳超临界流体提取条件。方法:根据Box－Behnken的中心组合实验设计原理，在单因素试验的基础上，采用三因素三水平的响应曲面分析法，建立白芍中芍药苷超临界流体提取的二次多项式数学模型，并以芍药苷提取率为响应值作响应面和等高线，考察萃取压力、萃取温度和甲醇浓度对芍药苷超临界提取的影响。结果:芍药苷超临界流体提取的优化工艺条件为:萃取压力为18.9 MPa，萃取温度为59.9℃，夹带剂甲醇浓度为68.5%，夹带剂流速0.4 mL/min，萃取时间为60 min。结论:在此提取条件下，芍药苷的理论提取率可达7.85 mg/g。

KEY WORDS:paeoniflorin;supercritical fluid extraction(SFE);response surface methodology(RSM);optimization of extraction condition

ABSTRACT:AIM:To develop a method for optimizing of supercritical fluid extraction(SFE)of paeoniflorin. METHODS:On the basis of one－factor test and the Box－Behnken central－composite design response surface with 3 factors and 3 levels was adopted.A second order quadratic equation for SFE of paeoniflorin was built.Response surface and contour were graphed with the extraction rate of paeoniflorin as the response value.Based on the analysis of the response surface plots and their corresponding contour plots，the effects of extraction pressure，extraction temperature，and methanol concentration were explored.RESULTS:By using the new method discussed above，the optimum extraction condition was obtained as follows:18.9 MPa extraction pressure，extraction cosolvent temperature 59.9℃，68.5%methanol was chosen as cosolvent with the flow rate of 0.4 mL/min，and extraction time 60 min.CONCLUSION:Under the optimized condition，extraction rate of paeoniflorin on theoretical value is 7.85 mg/g.

白芍为毛茛科植物毛果芍药(Paeonia lactifra Pall)的干燥根。性微寒、味苦、酸。具有平肝止痛、养血调经、敛阴止汗之功效，用于头晕、胁痛、腹痛、四肢挛痛，血虚萎黄，月经不调、自汗、盗汗［1］。白芍中的主要有效部位为白芍总苷，而其中有效成分芍药苷(Paeoniflorin)约占70%以上［2］，具有扩张冠状动脉，增加冠脉流量，对抗急性心肌缺血，抑制血小板凝聚及降低血压等药理作用［3，4］。白芍中芍药苷的定量检测通常采用高效液相色谱法［5，6］。对白芍药材中芍药苷的提取采用的方法有水、乙醇［5，7］、正丁醇和甲醇［8］，也有文献用超声提取法提取白芍中芍药苷［9］，但未见有用超临界流体提取技术(SFE)提取该成分的报道。

响应曲面方法(RSM)方法是其以回归模型作为函数估算的工具，将因子与试验结果(响应值)的相互关系用多项式拟合，研究因子与响应值之间、因子与因子之间的相互作用关系，并进行优化，是一种优化考察条件和加工工艺参数的有效方法［10］。本研究将其应用到白芍中芍药苷的超临界流体提取中，优化了提取条件。

1 材料与仪器

1.1 实验设备高效液相色谱仪(型号L－2400，日本日立公司(Hitachi));自动双重纯水蒸馏器(型号SZ－93，上海亚荣生化设备厂);万分之一电子天平(型号AL204，Mettler－Toledo Group);高速万能粉碎机(型号DJ灵巧型，天津市泰斯特仪器公司);超临界流体萃取仪(Spe－ed SFE，Applied Separations. Inc.(U.S.A));药典4号检验筛(浙江省上虞市纱筛厂)。

1.2 实验原料与试剂白芍购自北京同仁堂，产地安徽，经浙江大学宁波理工学院生化分院刘本教授鉴定;芍药苷标准品(中国药品生物制品检定所，批号110736);蒸馏水为双蒸水;工业液体CO2(纯度＞99.0%，宁波方辛气体公司);其它试剂均为分析纯。

2 实验方法

2.1 标准曲线的制备称取4 mg芍药苷标准品于10 mL量瓶中，加入甲醇适量，待完全溶解后定容至10 mL，配制浓度范围为5～100 μg/mL的溶液。在此范围内线性关系良好，标准曲线为:y=35 811x－9 586.8，R2=0.999 0。

2.2 样品处理将购得的白芍饮片经粉碎，过4号筛。取一份0.5 g该粉末与1.5 g硅藻土混合均匀，得样品，备用。

2.3 白芍中芍药苷的超临界流体提取将以上样品装入提取池，空体积用硅藻土填满。将提取池与超临界流体萃取装置连接，进行提取。提取条件为:静态萃取时间10 min，动态萃取时间30～120 min;压力15～30 MPa;温度50～70℃;CO2流速2 L/ min;夹带剂流量0.4 mL/min。提取物用装有5 mL甲醇的收集瓶收集。萃取结束后转入50 mL量瓶，用体积分数为40%的甲醇溶液定容至刻度，取1 mL溶液转入10 mL量瓶，并再次定容至刻度。该溶液用于HPLC分析。

2.4 HPLC条件ODS柱Diamond C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm，迪马公司);检测波长为230 nm［11］，流速为1.0 mL/min，流动相(甲醇－水=40∶60)，固定进样量20 μL。所有对照品和样品溶液进行HPLC分析前用0.45 μm滤膜过滤。

2.5 数据分析利用Design－Expert(version7.0，Stat－Ease Inc.，Minneapolis，MN.USA)软件进行响应面实验设计，数据分析和绘图(图1)。

图1 芍药苷标准品及白芍超临界流体提取样品HPLC图A.芍药苷标准品B.白芍超临界流体提取样品1.芍药苷

3 结果与讨论

3.1 萃取压力、萃取温度、萃取时间、甲醇浓度对芍药苷提取率的单因素影响试验影响芍药苷超临界提取的提取率的因素很多，如萃取压力、萃取温度、萃取时间、夹带剂及流速、CO2流速等。在做RSM分析前，应先通过单因素试验来选取试验因素与水平。

3.1.1 萃取压力固定萃取温度为60℃，萃取时间为60 min，夹带剂是体积分数为80%的甲醇，夹带剂流速为0.4 mL/min，CO2流速2 L/min，考察不同萃取压力对芍药苷超临界提取的提取率的影响，结果见图2。从图2可以看出，随着萃取压力的升高，芍药苷提取率有一定提高。芍药苷提取率在25 MPa前增加较为明显，以后成缓慢下降趋势。为减少能耗，选择萃取压力为20～30 MPa为宜。

图2 萃取压力对芍药苷提取率的影响(n=3)

3.1.2 萃取温度固定萃取压力为25 MPa，萃取时间为60 min，夹带剂为80%甲醇，夹带剂流速为0.4 mL/min，CO2流速2 L/min，考察不同萃取温度对芍药苷超临界提取的提取率的影响，结果见图3。从图3可以看出，在萃取压力为25 MPa，萃取时间为60 min，夹带剂为80%甲醇，当萃取温度在40～60℃时，芍药苷提取率有显著的提高，并在60℃左右达到最高，继续提高温度，芍药苷的提取率则有明显下降的趋势，故选择萃取温度范围在50～70℃之间。

图3 萃取温度对芍药苷提取率的影响(n=3)

3.1.3 萃取时间固定萃取压力为25 MPa，萃取温度为60℃，萃取时间为60 min，夹带剂为80%甲醇，夹带剂流速为0.4 mL/min，CO2流速2 L/min，考察不同萃取温度对芍药苷超临界提取的提取率的影响，结果见图4。从图4可以看出，在60 min内，芍药苷提取率随时间迅速提高，之后随萃取时间的延长，提取率增加缓慢。综合考虑原料本身芍药苷含量及成本，选择萃取时间为60 min为宜。

图4 萃取时间对芍药苷提取率的影响(n=3)

3.1.4 夹带剂种类固定萃取压力为25 MPa，萃取温度为60℃，萃取时间为60 min，夹带剂流速为0.4 mL/min，CO2流速2 L/min，考察不同夹带剂种类对芍药苷提取率的影响，结果见图5。从图5可以看出，当夹带剂为甲醇时，不同甲醇浓度对芍药苷提取率有较为显著的影响，在甲醇体积分数在20%～80%范围内时，提取率随甲醇浓度增加缓慢增加，在80%时达到最高提取率，而进一步增加甲醇浓度，提取率迅速下降。

图5 夹带剂对芍药苷提取率的影响(n=3)

当夹带剂为双蒸水时，其提取率仅比20%甲醇浓度的稍高，达5.84 mg/g，分析其主要原因可能是，甲醇体积分数较低时使大量杂质溶出，使得提取液变得黏稠，并对芍药苷产生吸附作用，不利于芍药苷的快速扩散溶出［12］;根据单因素试验结果，当甲醇体积分数较高(＞90%)时，提取率也很低。同时本实验也对比了在无夹带剂情况下芍药苷的超临界流体提取，提取率极低，考虑甲醇浓度对提取率有较大影响，故选取甲醇体积分数在60%～100%范围。

3.2 采用响应曲面法优化芍药苷超临界流体提取工艺

3.2.1 响应曲面分析因素水平的选取根据Box－Behnken的中心组合试验设计原理，结合上述单因素影响试验结果，固定萃取时间为60 min，选取萃取压力、萃取温度和甲醇浓度3个影响因素，在单因素试验的基础上采用三因素三水平的响应曲面分析方法，试验因素与水平设计见表1，共15个试验点，其中12个为析因点，3个为零点，零点试验进行了3次，以估计误差。

表1 白芍苷超临界流体提取试验的因素与水平

3.2.2 响应曲面分析方案及结果先对萃取压力(Z1)、萃取温度(Z2)和甲醇浓度(Z3)进行编码:

式中，xi为各参数的编码值，Zi为各参数的真实值，Z0为试验中心点处各参数的真实值，Z为各参数的变化步长，以芍药苷提取率为响应值(y)。芍药苷超临界流体提取响应曲面分析试验设计方案与试验结果见表2。

表2 芍药苷超临界流体提取试验设计与试验结果

3.2.3 实验数据分析实验数据分析采用Design－Expert软件(version7.0，Stat－Ease Inc.，Minneapolis，MN.USA)进行多元回归拟合、方差分析及显著性检验，得到以芍药苷提取率为目标函数，关于各条件编码值的二次回归方程为:

式中，萃取压力、萃取温度、甲醇浓度在分析中均经过线性编码处理，分别对应x1、x2、x3。因此，方程中各项系数绝对值的大小直接反映了各提取因素对响应值的影响程度，系数的正负反映了影响的方向。由回归方程知，夹带剂甲醇浓度的线性项以及它的二次项对提取率的影响非常显著。

对该模型进行显著性检验，结果见表3，回归模型系数显著性检验结果见表4。

表3 芍药苷超临界流体提取回归模型的方差分析结果

表4 芍药苷超临界流体提取回归模型系数的显著性检验结果

由表3可知，模型的P值为0.000 2，远小于0.01，说明该模型极显著;其中R2=98.93%，表明98.93%的实验数据可用该模型进行解释，说明方程可靠性较高。RSD值越低，显示实验稳定性越好，本实验中RSD值为8.68%，较低，说明实验操作稳定性较好。故该模型拟合程度良好，试验误差小，可以此模型来分析和预测超临界流体提取芍药苷的工艺结果。

由表4可知，回归方程的一次项x1，x2不显著，x3极显著;二次项x21和x22不显著，x23极显著;交互项均不显著;表明夹带剂甲醇浓度对芍药苷的超临界流体提取具有极大的影响，而萃取压力和萃取温度的影响均不明显，故各因素对芍药苷提取率的影响可以近似为线性关系。

3.2.4 芍药苷超临界提取工艺的响应面分析

图6 芍药苷超临界提取过程中萃取压力、萃取温度及其交互作用对提取率影响的响应曲面

图7 芍药苷超临界提取过程中萃取压力、甲醇浓度及其交互作用对提取率影响的响应曲面

图8 芍药苷超临界提取过程中萃取温度、甲醇浓度及其交互作用对提取率影响的响应曲面

由图7可以看出，萃取压力(Z1)和甲醇浓度(Z3)之间以及萃取温度(Z2)与甲醇浓度(Z3)之间的交互作用较明显，表现为等高线呈椭圆形。相比较而言，萃取压力(Z1)和萃取温度(Z2)之间的交互作用不明显。

由以上3组图可知，夹带剂甲醇浓度对芍药苷提取率的影响最为显著，曲线变化明显，由图可看出甲醇浓度最优值在70%附近;而萃取压力和萃取温度对芍药苷提取率的影响不明显，曲线变化较为平缓，响应值变化不明显。

为得出最优提取工艺条件，于是将回归模型取一阶偏导令其等于零，解关于x1、x2、x3的三元一次方程组，可以得到:x1=－1.216 8，x2=－0.005 8，x3=－0.577 3。变换为真实值可得:萃取压力为18.9 MPa，萃取温度为59.9℃，甲醇浓度为68.5%，在此条件下，芍药苷提取率理论值可达到7.85 mg/g。

为验证响应曲面法所得结果的可靠性，在上述优化提取条件进行芍药苷的超临界流体提取，在提取之前，为了实际的可操作性，将优化提取工艺参数进行修正:萃取压力19 MPa，萃取温度60℃，甲醇浓度70%，静态萃取时间10 min，动态萃取时间60 min，夹带剂流速为0.4 mL/min，CO2流速2 L/min。在此条件下平行提取3次，实际测得的平均提取率为7.48 mg/g，与理论预测值相比，其相对误差约为4.71%。

3.3 不同提取方法的比较分别采用不同提取方法来提取白芍中的芍药苷，并将提取结果做一比较。

表5 不同提取方法的比较

从表5可以看出，以上各提取方法中SFE具有提取时间短、效率高等优点，整体上优于索氏提取和超声提取。

4 结论

1)采用响应面试验设计方法得出的芍药苷超临界流体提取工艺参数的二次回归方程为:

方差分析结果表明:模型的P值为0.000 2，远小于0.01，表明回归模型极显著;其中R2=98. 93%，说明该方程能较好的预测芍药苷超临界流体提取率随各参数变化的规律。

2)利用回归方程得到的优化工艺参数为:萃取压力18.9 MPa，萃取温度59.9℃，甲醇浓度68.5%，静态萃取时间10 min，动态萃取时间60 min，夹带剂流速为0.4 mL/min，CO2流速2 L/min。考虑到实际操作的便利，对此条件进行适当修正后进行平行3次提取验证实验，得到芍药苷平均提取率为7.48 mg/g。本研究还对比了索氏提取及超声提取，其结果表明SFE提取具有提取时间短、效率高等优点，整体上优于索氏提取和超声提取。因此，利用响应面分析方法对芍药苷超临界流体提取工艺进行优化，可获得最优的提取参数，能有效降低提取条件组合的复杂性，为进一步工艺研究奠定基础。

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Optimization of supercritical fluid extraction of paeoniflorin by response surface methodology

TANG Lei1，2，LIU Ben1

(1.Department of Biological and Chemical Engineering，Ningbo Institute of Technology，Zhejiang University，Ningbo 315100，China;2.College of Materials Science and Chemical Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310027，China)

R284.2

A

1001－1528(2010)08－1332－06

2009－07－15

宁波市教育局资助项目(Jd070204，Jd090222)

汤磊(1984－)，男(回族)，硕士研究生，从事天然产物活性成分的提取与分离研究。Tel:13136379099 E－mail:tanglei198422@ 163.com

*通讯作者:刘本，教授，Tel:0574－88130089 E－mail:liuben@nit.zju.edu.cn