虎杖提取工艺研究及RP-HPLC同时测定虎杖提取物中3个成分的含量

赵鸿宾， 陈华国，2， 周 欣，2*， 龚小见，2， 何 艳， 赵 杨

（1.贵州师范大学天然药物质量控制研究中心，贵州 贵阳 550001；2.贵州师范大学贵州省山地环境信息系统与生态环境保护重点实验室，贵州 贵阳 550001）

中药虎杖为蓼科植物虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc)的干燥根和根茎，具有祛风利湿、散瘀定痛、止咳化痰等功效。根据文献报道［2］，虎杖的有效成分主要为蒽醌类和二苯乙烯类化合物，其中二苯乙烯类中的白藜芦醇和白藜芦醇苷独特功效引起人们的广泛关注；蒽醌类中的大黄素、大黄素甲醚具有抗菌活性和保肝、泻下作用，临床应用极其广泛。目前市场上已有以该植物入药的中成药制剂上市，如:天狮活力康胶囊，紫金胶囊，纳贝益生胶囊等。随着医药、化工和食品领域日益增长的需求，对虎杖提取物的需求量也越来越大。文献关于白藜芦醇的提取工艺研究较多，多以白藜芦醇的含量为指标确定工艺条件，本实验以白藜芦醇、大黄素、大黄素甲醚的含量作为指标考查不同工艺的提取方法和富集方法，并在此基础上建立了同时测定虎杖提取物中3个主要成分含量的RP-HPLC测定方法。

1 仪器、试剂与药品

仪器:Agilent 1100高效液相色谱仪(四元泵，DAD检测器，自动进样器)；十万分之一天平(梅特勒托利多)；试剂:甲醇(美国Tedia公司，色谱纯；天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯)；乙酸乙酯、石油醚(天津大茂化学试剂厂)；重蒸去离子水(实验室制备)；对照品:白藜芦醇(批号:111535-200502)、大黄素(批号:0756-9908)、大黄素甲醚(批号:0758-200206)均由中国药品生物制品检定所提供；样品:虎杖提取物来自白藜芦醇提取工艺所得提取物(1-7号样品为40%乙醇提取后用石油醚-乙酸乙酯萃取，其余样品为乙酸乙酯提取后用醇溶水沉除杂)。

2 方法与结果

2.1 提取工艺路线 (见图1)

图1 工艺路线图

2.2 含量测定方法

2.2.1 色谱条件 色谱柱:Agilent SB-C18(250 mm×4.6 mm 5 μm)；流动相:(A)H2O 与(C)CH3OH梯度洗脱；0～20 min，C(%)30→50；20 ～30 min，C(%)50→100；30 ～40 min，C(%)50→100，流速:1 mL/min；柱温:30℃；检测波长:303 nm；参比波长360 nm。在上述色谱条件下，供试品中的白藜芦醇、大黄素、大黄素甲醚完全达到基线分离，分离度大于1.5，按白藜芦醇、大黄素、大黄素甲醚峰计算理论板数均在4000以上。

2.2.2 对照品溶液的制备 取减压干燥至恒重的白藜芦醇、大黄素和大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL中含白藜芦醇0.21 mg、大黄素0.04 mg和大黄素甲醚0.03 mg的混合对照品溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取提取物10 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，称重，超声处理15 min，放冷，摇匀，补足减失重量，用0.45 μm微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液。

2.2.4 线性关系考察 精密量取2.2.2项下的混合对照品溶液 0.5、1、2、5、10、15、20 μL，按 2.1 项色谱条件分别进样分析，以对照品的进样量X(μg)为横坐标，峰面积值Y为纵坐标绘制标准曲线，回归方程分别为:白藜芦醇Y=4706.4X+43.323，r=0.9998，表明白藜芦醇进样量在0.105～4.2 μg范围内呈良好的线性关系；大黄素Y=2595.9X+21.057，r=0.9995，表明大黄素进样量在0.02～0.8 μg范围内呈良好的线性关系；大黄素甲醚Y=2602.8X－2.5468，r=1.0000，表明大黄素甲醚进样量在0.015～0.6 μg范围内呈良好的线性关系。见图2。

图2 HPLC色谱图

2.2.5 精密度试验 精密吸取2.2.2项下的混合对照品溶液20 μL，按上述色谱条件，重复进样6次，测定峰面积，计算平均相对标准偏差，结果白藜芦醇RSD=1.8%，大黄素RSD=0.3%，大黄素甲醚RSD=0.2%，说明仪器的精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 取同一批供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12 h 精密吸取 20 μL 注入液相色谱仪，测得峰面积，结果白藜芦醇、大黄素、大黄素甲醚的RSD分别为1.2%、1.0%、1.3%，表明供试品溶液至少在12 h内稳定。

2.2.7 重复性试验 取同一批号样品(编号8，乙酸乙酯回流提取)6份，按2.2.3项供试品溶液的制备方法分别制备供试液，测定3个成分的含量，结果白藜芦醇、大黄素、大黄素甲醚的平均含量分别为:24.7%、14.9%、3.4%；RSD分别为 1.02%、0.95%、0.87%，结果表明，该试验重复性良好。

2.2.8 回收率试验 采用加样回收法，精密称定已知含量的虎杖提取物，分别加入一定体积的白藜芦醇、大黄素、大黄素甲醚对照品溶液，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按2.2.1项下的色谱条件进行测定，结果白藜芦醇、大黄素、大黄素甲醚回收率分别为98.9%、98.3%、102.3%，RSD分别为2.3%、1.8%、2.2%(见表1～3)。

表1 白藜芦醇回收率实验结果

表2 大黄素回收率实验结果

表3 大黄素甲醚回收率实验结果

2.2.9 样品测定 取10批虎杖提取物，按照上述含量测定方法测定，测定结果见表4。

表4 样品测定结果(n=3)

2.2.10 主成分分析(PCA) 对2.1项下不同提取工艺所得提取物样品进行主成分分析，分析结果如下(见图3):

图3 PCA图

由主成分分析结果可见:10个提取工艺被分为两类，工艺8、9、10分为一类，其余为一类。

2.2.11 聚类分析(HCA) 对2.1项下不同提取工艺所得提取物样品进行主成分分析，分析结果如下(见图4):

由聚类分析结果可见:10个提取工艺被分为两类，即工艺2、3、5分为B类，其余为A类；在A类中工艺8单独为一类，即A-2类，其余为A-l类。

图4 HCA图

3 讨论

3.1 通过对2.1项下不同提取工艺所得提取物进行主成分分析，结果显示选用40%乙醇与乙酸乙酯作为提取溶剂，白藜芦醇、大黄素、大黄素甲醚的提取率和在提取物中含量有较大差异，采用乙酸乙酯提取时，3个成分的提取率和含量相对较高。而在聚类分析中，大致分为两类，即A、B类；在A类中，8、9、10 号样品采用乙酸乙酯提取，在 B 类中，2、5、3号样品采用40%乙醇回流，同样显示了提取溶剂对提取效果的影响较大，结果是选用乙酸乙酯提取效果较好。

3.2 通过分析可知，醇溶水沉(9、10号样品)对粗提物中各成分的含量影响不大，而选用石油醚-乙酸乙酯进行萃取有助于白藜芦醇的纯化，减小有机溶剂的极性(1、2、3号样品)可同时提高3种成分的含量，而白藜芦醇的含量变化最大，由此可知提取物中水溶性的成分含量较高。通过对4、5号样品结果分析表明萃取过程中乳化现象对各成分的含量会有较大影响，所以为防止乳化可对粗提物进行浸提。

3.3 本工艺在前人的基础上进行了改进，既提高了提取物中有效成分的含量，又使工艺简单化；此含量测定方法能准确、快速地测定虎杖提取物中白藜芦醇、大黄素和大黄素甲醚的含量，且分离效果好，可用于虎杖提取物质量控制。

［1］中国药典［S］.一部.2005:145.

［2］刘 丹，汤海峰，张三奇，等.虎杖中有效成分提取方法的研究［J］. 中成药，2007，29(4):516-521.

［3］齐 辉，张 勉，王峥涛.HPLC同时测定虎杖中4种成分的含量［J］. 中国中药杂志，2006，31(23):2003-2005.

［4］江 曙，朱蓉蓉，张 芳，等.虎杖中白藜芦醇提取方法及工艺的优化［J］.南京中医药大学学报，2006，22(3):197-199.

［5］杨汉荣，李来生，陈雄泉.高效液相色谱法测定虎杖中白藜芦醇、白藜芦醇苷和游离大黄素［J］.理化检验 －化学分册，2008，44(3):234-236.