丹参红色素的亚临界水萃取工艺

张丽影，于国萍,*，于纯淼

(1.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.黑龙江中医药大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

丹参红色素的亚临界水萃取工艺

张丽影1，于国萍1,*，于纯淼2

(1.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.黑龙江中医药大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

利用亚临界水萃取丹参药材中的丹参红色素。以丹参酮Ⅱ-A的提取率作为丹参红色素提取率的考察指标，通过单因素试验研究在丹参红色素的亚临界水萃取过程中萃取温度、萃取时间、物料粒径、液固比、提取剂乙醇体积分数因素对丹参红色素提取率的影响。在单因素试验结果的基础上，选择萃取温度、萃取时间、物料粒径、液固比4个因素进行正交试验，确定丹参红色素的最佳亚临界水萃取工艺。结果表明：4个因素对丹参红色素提取率影响的主次顺序为温度>物料粒径>料液比>时间；最优组合为A3B1C1D3，即萃取温度200℃、物料粒径40～60目、液固比25:1(mL/g)、萃取时间10min。在此最优组合基础之上，选择体积分数15%乙醇溶液作为萃取溶进行萃取，此时所得色素提取率最高为0.319%。

丹参；亚临界水；丹参酮Ⅱ-A；丹参红色素；提取率

Abstract：Red pigment was extracted fromSalvia miltiorrhizausing subcritical water. The major factors including extraction temperature, extraction time, particle size, liquid-material ratio and ethanol concentration played an important role in subcritical water extraction processing. The effects of above factors on extraction rate of red pigment were investigated. Moreover, the optimal extraction conditions of red pigment were explored by orthogonal experiments to be extraction temperature of 200 ℃,particle size of 40－60 meshes, liquid-material ratio of 25:1, extraction time of 10 min and ethanol concentration of 15%. The extraction rate of red pigment fromSalvia miltiorrhizawas 0.319% under the optimal extraction conditions.

Key words：Salvia miltiorrhiza；subcritical water；tanshinone II-A；red pigment；extraction rate

丹参系唇形科鼠尾草属植物(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根茎，具有活血通经、除烦清心[1-2]、改善冠脉循环、消炎抗菌等药理作用，并且对癌细胞转移和血行扩散有明显促进作用。丹参药用有效成分分为脂溶性和水溶性两大部分[3-4]。目前从丹参中分离得到的脂溶性成分和水溶性成分据报道有34种之多[5]。脂溶性成分为二帖醌类化合物，为色素成分，称为丹参红色素，也称为总丹参酮。该色素是一种天然食用色素，安全性高，具有一定的药理作用，有利于人体健康。

常用的丹参红色素提取方法有水煎煮法、有机溶剂浸提法、超临界CO2提取法等。这些方法或是提取时间长、有机溶剂使用量大，或是对有效成分的选择能力较差。亚临界水(subcritical water，SBW)是指压力和(或)温度在其临界值(T=374℃，P=21.8MPa)之下的附近区域的液态水[6-7]。亚临界水萃取技术(subcritical water extraction，SWBE)是指以水为提取剂，通过改变萃取温度，改变水的极性，从而可以选择性的萃取样品中的无机或有机、极性或非极性的有机化合物[8]。SWBE是一种近十几年发展起来的较新的不使用或少使用有机溶剂的绿色萃取技术[9]，具有设备简单、易于操作、快速、得率高等优点，其在中药的生产、应用和分析领域有着很好的发展前景。因此，本实验进行丹参红色素的亚临界水萃取技术的研究，为中药有效成分的提取提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

丹参根茎 宝丰医药有限公司；丹参酮Ⅱ-A标准品 中国药品生物检定所；蒸馏水、无水乙醇、乙酸乙酯(均为分析纯)。

1.2 仪器与设备

FW-100型万能粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司；RE-52型旋转蒸发仪 上海博通仪器设备有限公司；SHZ-3循环水多用真空泵 郑州杜甫仪器厂；DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；KCFD05-03型亚临界反应釜 烟台高新区科立自控设备研究所；AL-104型精密电子天平 上海梅特勒-托利多仪器设备有限公司；FDU-1100型冷冻干燥机 东京RIKAKIKAI公司；KQ-500B型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；UVmini-1240紫外-可见分光光度计 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 原料预处理

使用万能粉碎机将干燥的丹参根茎粉碎、过筛，得到不同物料粒径的丹参粉末，备用。

1.3.2 亚临界水萃取丹参红色素的影响因素

考察萃取温度、萃取时间、物料粒径、料液比和提取剂乙醇体积分数5个因素[10-11]对丹参红色素提取率的影响。称取一定物料粒径的丹参粉末适量，用不同液固比的亚临界水在一定温度下萃取一定时间进行单因素试验。确定单因素水平后，在单因素试验的基础上选择萃取温度、萃取时间、物料粒径、料液比进行正交试验，确定丹参红色素的最佳亚临界水萃取工艺条件。其中萃取温度为120、140、160、180、200℃；萃取时间为5、10、15、20、25min；物料粒径为≤40、40～60、60～80、80～100、≥100目；液固比为10:1、15:1、20:1、25:1(mL/g)；乙醇体积分数为0、5%、10%、15%、20%。

1.3.3 丹参红色素提取率的测定方法

丹参红色素也称总丹参酮，以其中的主要成分丹参酮Ⅱ-A作为丹参红色素的考察指标，进行色素提取率的计算。对亚临界水萃取液冷却抽滤，乙酸乙酯萃取分离，萃取后的脂相使用紫外-可见分光光度计在丹参酮Ⅱ-A最大吸收波长处测定OD值，计算色素提取率[12]。

1.3.4 丹参酮Ⅱ-A提取量的测定方法

精密称取干燥至恒质量的丹参酮Ⅱ-A标准品2mg，置于10mL容量瓶中，加入适量乙酸乙酯溶液并定容至刻度，准确吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL标准品溶液分别置于10mL容量瓶中，加乙酸乙酯至刻度，得质量浓度为10、20、30、40、50μg/mL的溶液，备用。

2 结果与分析

2.1 丹参酮Ⅱ-A标准曲线

对标准液进行扫描得丹参酮Ⅱ-A的最大吸收波长为449.5nm。在449.5nm条件下测定OD值，以OD值与丹参酮Ⅱ-A溶液质量浓度进行线形回归，得标准曲线方程：Y=0.0108X－0.0104，r2=0.9998，式中：Y为OD值，X为丹参酮Ⅱ-A质量浓度/(μg/mL)，线性关系良好。线性范围为10～50μg/mL。依据此曲线得出样品中丹参酮Ⅱ-A的质量浓度，并计算提取率。

2.2 亚临界水萃取丹参红色素的研究

2.2.1 温度对丹参红色素提取率的影响

图1 温度对丹参红色素提取率的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on extraction rate of red pigment fromSalvia miltiorrhiza

如图1所示，丹参红色素的提取率随着萃取温度的升高而增加，由120℃时的0.035%增加到180℃时的0.166%，提取率相对增加了4倍，且当温度超过140℃时有显著影响(P＜0.05)。这主要是因为萃取温度是影响亚临界水萃取技术的最主要因素，对萃取的速度、效率、选择性都有很大的影响[13]。改变亚临界水的萃取温度，水的极性也随之发生了改变，进而选择性的萃取被提物中的极性或非极性的目标成分。升高温度可以打破分子间的偶极引力、破坏被提物的中心结构，进而破坏被提物与目标成分间的相互作用力；同时升高温度还可以降低流体黏度，使流体更易渗入被提物中，提高提取率。当温度超过180℃后，药材严重碳化，有明显的焦糊味，萃取液颜色由棕红色变为黑褐色，色

素提取率虽有所增加，但增加趋势不明显。这可能是因为当温度超过180℃以后，反应釜内压强有所增加，提取率升高。但由于压力对亚临界水萃取效率影响不大，只要适当的压力使水保持液态即可实现亚临界水萃取[14-15]。本实验的压力可达2MPa，故不考虑压力作为萃取因素对提取率的影响。提取率增加不明显也可能是因为受丹参酮稳定性的限制，温度过高易分解[16]。因此选择萃取温度180℃。

2.2.2 萃取时间对丹参红色素提取率的影响

图2 萃取时间对丹参红色素提取率的影响Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of red pigment fromSalvia miltiorrhiza

如图2所示，时间对色素提取率影响显著(P＜0.05)。随着萃取时间由5min增加到的15min时，提取率由0.090%增加到0.168%，提取率大约相对增加了88%；而当萃取时间由15min增加到25min时，提取率呈现了减小的趋势。出现这种现象的原因可能是萃取时间在亚临界水萃取中影响也较大。萃取时间的选择在很大程度上取决于萃取温度以及目标成分与被提物基质间的天然性质。亚临界水的萃取时间随温度的升高而减少，在适当的时间内即可萃取完全。当提取时间过长时，目标成分受热稳定性的限制，在亚临界状态下易分解，提取率下降。同时这种现象可能是与组分之间存在“溶解互助”效应[17]有关：药材成分复杂，其中性质相近的组分之间可互为提取剂。提取时间过长，由于其中某些组分的分解而失去相互提携的优势。用尽量短的时间，更有利于整个萃取效率的提高。因此丹参红色素的萃取时间选择为15min。

2.2.3 物料粒径对丹参红色素提取率的影响

如图3所示，物料粒径对丹参红色素提取率有显著影响(P＜0.05)。当物料粒径不超过60～80目时，随着物料粒径的减小，丹参红色素的提取率呈现增大的趋势，由起初的0.104%增加到了0.161%提取率大约相对增加了60%。这主要是由于在液固萃取过程中，丹参粒径的减小，使其表面积增加，液固界面面积增加，有利于溶剂渗透到被提物中，使得目标成分被有效萃取，显著提高了色素提取率[18]。但当物料粒径超过60～80目时，提取率呈现了减小的趋势。样品颗粒过细，在较高的温度下焦糊现象明显，甚至出现了结块现象，不利于目标成分的提取，而且在实验中不易操作处理。故物料粒径选择为60～80目。

图3 物料粒径对丹参红色素提取率的影响Fig.3 Effect of particle size on extraction rate of red pigment fromSalvia miltiorrhiza

2.2.4 液固比对丹参红色素提取率的影响

图4 液固比对丹参红色素提取率的影响Fig.4 Effect of liquid-material ratio on extraction rate of red pigment fromSalvia miltiorrhiza

如图4所示，当液固比由10:1(mL/g)增加到20:1(mL/g)时，丹参红色素提取率由0.107%增加到了0.168%，提取率相对增加了55.45%，液固比对色素提取率影响显著(P＜0.05)；当液固比高于20:1(mL/g)时，色素提取率虽有所增加，但增加趋势不明显，影响不显著。出现这种现象的原因可能是亚临界水萃取是在一定的温度和压力下进行的，萃取罐中水溶液体积的大小不仅会影响到罐中萃取压力的大小，也同时会影响样品在萃取液中的分散程度。随着液固比增加，更多的萃取溶剂渗透到物料中，目标成分与溶剂接触面积增大，使得目标成分更有效地被萃取，进而提高对目标成分的提取率。同时本实验是在固定质量的条件下，通过改变液体体积改变液固比。随着液体体积增加，反应釜内压力增加，提取率也随之增加。但当液固比超过20:1(mL/g)后，提取率增加趋势不明显。因此根据试验条件选择液固比为20:1(mL/g)，即选择溶剂-蒸馏水的体积与物料丹参粉末的质量的比为20:1(mL/g)进行试验。

2.2.5 提取剂乙醇体积分数[10,19]对丹参红色素提取率的影响

图5 乙醇体积分数对丹参红色素提取率的影响Fig.5 Effect of ethanol concentration on extraction rate of red pigment fromSalvia miltiorrhiza

如图5所示，当向萃取溶剂中加入0～20%乙醇时，乙醇体积分数对丹参红色素的提取率影响显著(P＜0.05)。未加乙醇时，丹参红色素的提取率为0.193%；随着萃取溶剂中乙醇体积分数增加到20%时，色素提取率增加到了0.334%，与未添加乙醇相比，提取率约增加了74%。这主要是因为当向水中加入提取剂以后，大大加强了被分离组分在亚临界水中的溶解度，使该溶质的分离因子大大提高，增加溶质溶解度对温度的敏感程度。因此加入提取剂的亚临界水对植物原料中天然存在的目标成分的溶解能力增加，目标成分的提取率明显增加。与传统的有机溶剂浸提相比，有机溶剂的消耗大大降低了。

2.2.6 丹参红色素提取条件的优化

表1 L9(34)试验方案及试验结果Table 1 Design and results of orthogonal experiments

在以上单因素试验的基础上，不添加乙醇，以萃取温度、萃取时间、物料粒径、液固比为因素，设计四因素三水平正交试验，以确定最佳的亚临界水萃取工艺。试验方案及结果见表1。

正交试验极差分析结果表明，各因素对丹参红色素的提取率影响的主次顺序为温度＞物料粒径＞液固比＞时间。提取丹参红色素的最佳工艺组合为A3B1C1D3，即温度200℃、时间10min、物料粒径40～60目、液固比25:1(mL/g)。验证实验结果表明：在此最佳条件下丹参红色素的提取率为0.244%。

在上述正交试验结果基础上，称取物料粒径为40～60目的丹参粉末适量，按照25:1(mL/g)的液固比向萃取溶剂中加入15%的乙醇，在200℃条件下萃取10min。此条件下所得粗提色素提取率为0.319%，相对纯水作为萃取溶剂，其提取率约增加了31%。

3 结 论

丹参红色素的最优亚临界水萃取条件为萃取温度200℃、液固比25:1(mL/g)、物料粒径40～60目、提取剂乙醇体积分数15%、萃取时间10min，此条件下所得丹参红色素提取率为0.319%。但是相对于丹参中丹参酮的含量，该色素提取率偏低，这可能是因为丹参红色素是由多种丹参酮组成的，仅以丹参酮Ⅱ-A提取量作为色素提取率的考察指标过于单一，应考虑多种丹参酮提取量。同时影响亚临界水萃取的因素主要包括萃取温度、压强、时间、料液比、物料粒径以及提取剂种类和浓度等。本实验仅是在萃取温度、萃取时间、物料粒径、固液比和乙醇体积分数5个因素条件下进行研究，其他影响亚临界水萃取技术的因素以及所提色素的稳定性和药用价值还有待进一步研究。

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Optimal Extraction Processing of Red Pigment inSalvia miltiorrhizaby Subcritical Water

ZHANG Li-ying1，YU Guo-ping1,*，YU Chun-miao2
(1. College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China；2. College of Pharmacy, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

TS202.3

A

1002-6630(2010)22-0110-05

2010-06-28

黑龙江省中医药、中西医结合重点科研项目(ZHY08-Z03)

张丽影(1985—)，女，硕士研究生，研究方向为农产品精深加工。E-mail：xiaoyingzi_2004@163.com

*通信作者：于国萍(1963—)，女，教授，博士，研究方向为食品化学。E-mail：yuguopingneau@hotmail.com