饲用α-半乳糖苷酶稳定性及酶学特性的研究

中国农业大学动物科技学院 王春林 陆文清

α-半乳糖苷酶是消除饲料原料中α-半乳糖苷聚糖类抗营养因子的饲用外源酶类 （张丽英，2000；Leske和 Coon，1999）。但酶在加工应用过程中先经受原料混合加工、高温制粒、运输和储存等环节后，才在动物胃肠道溶解发生作用，所以酶制剂的稳定性倍受关注。α-半乳糖苷酶理化性质的研究对其在饲料中的应用具有指导意义。本试验对α-半乳糖苷酶粗制品的耐酸、耐温和耐储存性能进行了测定，体外研究了动物消化液对酶活力的影响，探讨了粗酶-底物作用的动力学特征。

1 材料与方法

1.1 酶样与酶活测定 酶样取自青霉菌（Penicillium sp.MAFIC-6）固态发酵生产的α-半乳糖苷酶粗酶制剂，测试样品为原酶干粉或原酶稀释液。酶活分析方法参照Wang等（2004）。

1.2 pH对酶活力及稳定性的影响 用醋酸-醋酸钠缓冲溶液 （pH 3.6 ～ 5.6，0.05 mol/L）、NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液 （pH 5.7 ～8.0，0.10 mol/L）、Tris-盐酸缓冲溶液 （pH 6.8 ～9.2，0.10 mol/L）和 Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液（pH 9.2～10.7，0.10 mol/L）配制pH为2.5～12.5的缓冲体系，测定相同酶液在不同pH条件下的酶活力，确定最适pH。为观察酶的pH稳定性，用pH 2.5～12.5反应液在40℃分别孵育酶液1、2 h和12 h，再按常规方法测定残余酶活力。

1.3 温度对酶活力及稳定性的影响 将酶液置于30～100℃温度下反应测定不同温度下的酶活力，确定酶作用的最适温度。为了解酶在湿热下的稳定性，将相同的稀释酶液分别在30～100℃下处理30 min和60 min，冷却后按常规方法测定残余酶活力。为了解酶在干热下的稳定性，用金属铝盒称取干酶粉2.0 g左右，置于30～100℃温度处理30 min和60 min，冷却后测定残余酶活力。结果表示为相对酶活力。

1.4 金属离子对酶活力的影响 分别配制10×10-3mol/L的金属离子（见表1）溶液，用酶液混合稀释使离子在体系中的终浓度为1×10-3mol/L或1×10-4mol/L，于 40 ℃保温 30 min，然后按常规方法测定α-半乳糖苷酶活力。结果表示为相对于未经金属离子处理的酶活力的百分比例。

1.5 猪消化液对酶活力的影响 选取6头体重（20±0.5）kg健康的达兰猪，屠宰后分别从胃幽门部和小肠空肠部位取内容物，迅速用8层纱布过滤，4℃下4000 r/min离心20 min，取上清液装棕色瓶-20℃冷冻保存备用。分别用醋酸缓冲溶液（pH 5.5）、胃液（pH 4.0 ～ 4.3）和小肠液（pH 6.1 ～6.3）混合原酶液（V/V 为 9∶1），放置 12 h 和 24 h。其中部分样品用胃液处理12 h后继续用肠液处理12 h。最终在统一条件下测定混合液残余酶活力。以醋酸缓冲液的酶活力为对照，其他酶活与之相比的百分数为相对酶活力。

1.6 酶的耐储藏试验 选取起始酶活不同的两个中试干燥酶样品 （水分 <8%）。在常温15～30℃和相对湿度 <50%条件下密封保存9个月，分别在3、6月和9月时取样测定α-半乳糖苷酶活力，每个样取6个平行。

2 结果与讨论

2.1 pH对酶活的影响 酶的活性受所在环境pH的影响。pH改变能影响酶分子活性部位上有关基团的解离。在非最适pH时，活性基团的解离状态发生改变，酶底物的结合力降低，因而酶促反应速度降低。此外，环境过酸、过碱能使酶蛋白本身变性失活。酶作为一种活性蛋白质，酶-底物体系的酸碱度影响到酶分子结构域、酶与底物的离子化程度及其间的亲和力，一定的解离状态最适合其催化反应，极端pH条件对酶可引起不可逆的破坏，使酶失活（沈同和王镜岩，1991）。图1表明，α-半乳糖苷酶最适pH为4.5。酶在不同pH反应体系中分别保温1、2 h和12 h后，剩余酶活力呈现了相似的变化趋势。以pH 4.5的相对酶活力为100%，当pH超过6.5时，3个时间的酶活力均保持在67%左右，随后酶活迅速下降，到7.5时酶活保持依次为22.46%、20.51%和20.50%，到pH 8.5时，酶活均下降到10.5%以下。在pH 3.5以下时，3个时间点的酶活依次为16.82%、80.18%和53.04%，说明该酶具有较强的耐酸性能。由此可见，该酶的稳定pH在3.5～6.5。

图1 pH对酶活力及稳定性影响

2.2 温度对酶活稳定性的影响 酶是一种生物活性催化剂，具有一般催化剂的性质，即其催化效率在一定范围随温度升高而增加，但酶蛋白又会随温度升高逐渐变性而丧失催化活性。酶作用最适温度是这两种效应的综合体现。图2表明，酶的最适温度在50～60℃。以30℃的相对酶活力为100%，在反应液中，酶在60℃保持30 min和60 min时的相对酶活力仍保持在90.67%和85.95%，但到70℃时，酶活迅速消失。图3表明，酶在干热条件下稳定性比湿热高，超过80℃处理30 min或60 min，酶活仍保持在80%以上，显然热处理时间越长，酶活损失越快。因此，认为酶在70℃以下时是稳定的。

图2 湿热对酶活力及稳定性的影响

图3 干热对酶稳定性的影响

2.3 金属离子对酶活力的影响 结果如表2所示。在离子浓度较高（1×10-3mol/L）时，各种金属离子均不同程度地抑制了酶活；在低离子浓度（1×10-4mol/L） 时，Co2+和 Mn2+对酶活力有轻微的促进作用，Zn2+、Sn2+和Ca2+几乎无影响。两种浓度的Ag+和Hg2+均强烈抑制了酶活。

表2 金属离子对酶活力的影响 %

2.4 猪消化液对酶活的影响 表3结果表明，酶经过胃液、肠液和二者连续的处理后，酶活力较对照组均显著下降（P<0.05），但酶活力在胃液中最高，12 h达90.74%，24 h达86.87%，可能是胃液的pH最接近该酶最适pH范围的缘故。在小肠液或胃液+小肠液中酶活下降较快，但经过12 h处理仍保持在70%以上。随着时间延长各处理酶活均显著降低（P<0.05）。由此证明α-半乳糖苷酶在动物胃肠道内仍能较稳定地发挥活性。

表3 猪消化液对α-半乳糖苷酶活力及稳定性的影响

2.5 储存时间对酶活的影响 固态发酵的原酶样，经过3、6个月和9个月的常规储存后测定α-半乳糖苷酶活力，结果表明（见表4），在0～4℃冷藏9个月酶活力不受影响。在常温15～30℃保存时，3月之内酶活不受影响，但随后活力损失显著（P<0.05），但到6个月时仍保留有原始活力的90.30%，到9个月时有80.58%，可见酶活在储存条件下比较稳定，能够适应生产实际中储存的需要。

表4 储存时间对酶活的影响

3 小结

通过对α-半乳糖苷酶粗酶制剂的理化性质研究表明，该酶的适宜pH在酸性范围 （3.5～6.5），适宜的温度在70℃以下，能够耐受猪胃肠液12 h，货架期长。

[1]沈同，王镜岩.生物化学（上册）[M].北京：高等教育出版社（第二版），1991.232～328.

[2]张丽英.大豆寡糖对断奶仔猪抗营养作用及机理的研究：[博士学位论文][D].北京：中国农业大学，2000.

[3]Leske，K L，Coon C N.Hydrogen gas production of broiler chicks in response to soybean meal and α -galactoside free，ethanol-extracted soybean meal[J].Poult Sci，1999，78：1313 ～ 1316.

[4]Wang，C L，Li D F，Lu W Q，et al.Influence of cultivating conditions on the α-galactosidase biosynthesis from a novel strain of Penicillium sp.in SSF[J].Lett App Microb，2004，39：369 ～ 375.