犊牛源乳酸菌的筛选及抑菌性能研究

东北农业大学动物科学技术学院 郭奇苑 孙 文 徐基利 许 丽

动物胃肠道微生物区系从多方面影响机体微生态环境的稳定和动物健康。然而由于动物种类和环境的不同，定植肠道细菌的种类和数量相差很大，定植的能力也不尽相同（Chiquette，2009）。理想的益生素菌种最好来自同源动物的肠道。对反刍动物的不同生长阶段使用不同的益生素，并充分考虑其使用目的，才能以最经济的方式达到最理想的效果。幼犊的腹泻是由寄生在肠道中能产生肠毒素的细菌引起的，微生态制剂中的益生菌可抑制致病菌在肠道的定植，同时可产生对致病菌有抑制作用的生物活性物质。本试验选取15日龄健康犊牛，对肠道内容物以及肠黏膜上的乳酸菌进行了分离鉴定，筛选耐受性和抑菌效果良好的菌株，从而为开发促进犊牛生长、防治犊牛腹泻性疾病的微生态制剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品采集 选择15日龄未饲用抗生素的健康荷斯坦犊牛放血屠宰。结扎截取十二指肠、空肠、回肠、盲肠和直肠肠段，冰冻保存，迅速带回实验室。

1.1.2 质控菌株 大肠杆菌（Escherichia coli），致病性大肠杆菌（C83092）由黑龙江八一农垦大学动物科技学院微生物实验室赠送。

1.1.3 培养基 MRS液体和固体培养基，LB培养基。

1.1.4 主要试剂 牛胆盐 （北京奥博星公司）、胃蛋白酶（Sigma）、3%过氧化氢、革兰氏染液。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的分离与命名 分别取不同肠段食糜0.5 g于4.5 mL无菌生理盐水中，连续进行倍比梯度稀释，吸取10-6、10-7梯度稀释液0.1 mL于MRS平板上涂布；取健康犊牛肠道黏膜4 cm2（十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠），用无菌生理盐水冲洗黏膜至无可见食糜，用无菌棉棒擦拭肠黏膜上皮，划线涂于MRS平板上。将上述平板放置于37℃恒温厌氧培养箱（5%CO2）培养24～48 h，挑取单个菌落，反复划线分离至获得纯菌株，并进行革兰染色，显微镜检，选择革兰氏染色阳性、过氧化氢酶接触阴性且无芽孢的菌株为后备菌株贮存备用。

菌株的命名根据肠道来源不同，以拼音首字母代表，如分离于回肠食糜的第一株命名为H1，分离于空肠壁第二株则为KB2。

1.2.2 耐酸性试验 把上述分离到的菌株活化，接种于液体培养基，培养18～24 h后，将液体培养物按5%（V/V）的接种量接入pH值2.0的MRS液体培养基中，同时以pH值6.25的MRS培养基作为对照。置于37℃恒温摇床中培养2 h，而后取0.1 mL菌悬液，进行平皿菌落计数。计算酸处理过的菌株存活率：a1/a0×100%，a1： 各处理组 2 h 后的每毫升活菌数（CFU/mL），a0：对照组每毫升活菌数（CFU/mL）。

1.2.3 耐胆盐试验 在MRS液体培养基分别添加 0%、0.1%、0.2%、0.3%（m/V）的牛胆盐，接种5%（V/V）已活化的菌种，方法同上，处理2 h后计算菌株存活率。

1.2.4 胃蛋白酶耐受性试验 以液体MRS培养基为基础，用体积分数37%的盐酸将其调至pH=3.0，再加入 5 mg/mL 胃蛋白酶（3000 NF U/mg）作为模拟胃液，以不加胃蛋白酶且pH值6.25的MRS液体培养基作为对照，将试验菌株的液体培养物按5%（V/V）的接种量接入，在37℃恒温条件下培养2 h取样测定活菌数，计算存活率。

1.2.5 抑菌性试验 均匀涂布受试大肠杆菌和大肠杆菌C83092悬液于LB营养琼脂平板，用无菌镊子夹取已灭菌的牛津杯于培养基上。在牛津杯中加200 μL的乳酸菌液体培养物，每个样品4个重复。加完样后置4℃冰箱静置固定30 min，然后放入37℃培养箱培养18 h，测量抑菌圈直径，取平均值。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离 本试验从15日龄犊牛不同部位肠道食糜和肠道黏膜共分离出35株无芽孢乳酸菌，其中31株为革兰氏染色阳性菌。通过镜检，有12株为球菌，其中10株来自肠道食糜，2株来自肠道壁。剩余19株杆菌中有9株来自肠道食糜，10株来自肠道壁。在MRS培养基上菌落形态多呈现乳白色，表面光滑，圆形凸起，边缘整齐。

2.2 耐酸性试验 由表 1可以看出，SB1、SB2、M5都表现出较强的耐受性，酸处理2 h后存活率仍达到30%以上；MB3、M7、Z4对酸也有一定的耐受性，存活率均可超过20%；而K1、ZB1、HB3在此条件下较为敏感，存活率分别为14.22%、8.74%和7.16%；其余菌株生长则受到强烈的抑制，存活率均在5%以下。十二指肠壁分离出的两株乳酸菌与其他部位相比耐酸特性较好，而且强于同肠道食糜中分离到的。最终以存活率5%为界限，选定SB1、SB2等9株菌进行下一步的筛选。

表1 pH=2条件下31株乳酸菌耐酸存活率

2.3 耐胆盐试验 由表2可见，不同质量浓度的牛胆盐对试验菌均有抑制作用，质量浓度增加抑制作用也随之增强，不同菌株对胆盐的耐受性表现出一定的差异。在胆盐浓度为0.1%，处理2 h后，M7的耐受性最强，达到了70.31%。其他菌株的耐胆盐性从高到低依次为 K1、SB2、M5、SB1、HB3、Z4，存活率都超过了 25%；而 ZB1和 MB3对此浓度胆盐则较敏感，存活率在20%以下。当胆盐浓度达到0.2%时，各菌株存活率迅速下降，胆盐的抑制作用明显，存活率最高的SB2仅为2.25%，其他均未超过1%。胆盐浓度上升至0.3%时，牛胆盐对各菌株表现出强烈的抑制作用，存活率均未达到0.5%。

表2 9株菌在不同胆盐浓度中的存活率 %

2.4 胃蛋白酶耐受性试验 由表3可见，与对照组相比，各菌株的生长都受到胃蛋白酶的抑制，处理2 h后活菌数均有所减少。Z4耐受性较强，在人工胃液中保持2 h后，存活率可以达到79.14%。M5与M7经处理后的活菌数分别为4.83×108CFU/mL 和 4.45×108CFU/mL， 存活率也在50%以上。SB1、K1、MB3的存活率在30.90%～38.79%。菌株SB2、HB3、ZB1的生长受到明显的抑制，对胃蛋白酶的耐受力相对较差，存活率不到20%。综合以上耐盐及耐酶结果，菌株M5、M7、SB1和Z4表现出良好的耐受性。

表3 人工胃液处理对9株菌活菌数及存活率的影响

2.5 抑菌性试验 由表4可以看出，4株乳酸菌全液对两株大肠杆菌指示菌都有较强的抑制作用，而且对弱毒性大肠杆菌的抑制作用要优于普通埃希氏大肠杆菌。Z4对弱毒性大肠杆菌C83092的抑制效果最强，抑菌圈直径可以达到21.02 mm；M7、M5、SB1 的抑菌直径在 19.48 ～20.30 mm，但4株菌的抑菌效果差异不显著（P>0.05）。乳酸菌全液对埃希氏大肠杆菌的抑菌圈在16.42～16.94 mm，4株菌的抑菌效果差异不显著（P>0.05）。

表4 4株乳酸菌全液对大肠杆菌的抑制作用

3 讨论

3.1 菌株的分离 益生菌菌株定植的宿主特异性直接影响到益生菌制剂的应用效果，因而菌种的分离选择必须注意到宿主特异性问题 （赵瑞香等，2002），理想的益生素菌种最好来自同源动物的肠道。胃肠道菌群是在长期进化过程中形成，与宿主保持相对平衡稳定的状态，对畜禽的生长发育和抵抗疾病具有重要意义（孙志洪等，2007）。嗜酸性乳酸杆菌可降低肠道中大肠杆菌的数量。在这方面，从犊牛肠道中分离出来的嗜酸性乳酸杆菌的作用效果要好于从仔猪肠道中分离出来的（Wallace 和 Newbold，1992）。 其次许多从鸡分离的乳酸杆菌只对鸡小肠黏膜上皮细胞有黏附力，而对大鼠和猪等则没有黏附力，同样从大猪上分离的乳酸杆菌对小猪的肠黏膜上皮细胞黏附力较差（黄沧海等，2004）。 另据 Klaenhammer（1982）报道，形成光滑菌落的乳杆菌生长速度快，在冷冻和干燥过程中存活率高，对胆盐的耐受力也优于形成粗糙菌落的菌株。

3.2 酸耐受性 新生犊牛的胃肠道环境类似于单胃哺乳动物，而且尚未完全发育，幼龄动物胃肠道内的pH值一般在3～4。王传彬等（1997）研究结果表明，动物源乳杆菌对pH 2.5肉汤处理很敏感，而在pH 3.0肉汤中保温2 h，存活率达70%以上。刘虹等（2006）对分离自肉鸡肠道3株产酸能力强的乳酸菌研究，pH值为2时接种3 h有一株仍能检测到活菌数，但都对pH值为2.0的酸性环境非常敏感，同时活菌数不超过107CFU/mL。

3.3 胆盐耐受性 动物肠道内胆汁浓度是不断变化的，因而很难预测其在某一时间段内的浓度，但总的来说，小肠中胆盐含量通常在0.03%～0.3%。Gilliland等（1984）报道，从犊牛分离的7株嗜酸乳杆菌中的3株菌对0.3%的胆盐耐受性较好。李少英（2008）报道，从犊牛粪便中分离出的乳杆菌和双歧杆菌能在0.1%的胆盐环境中生长，有的存活率可达到80%以上，在胆盐浓度为0.2%的培养基中，菌株的生长作用受到抑制，而且随着胆盐的添加，抑制菌株生长的作用明显加强。吴惠芬（2003）选用从仔猪肠道食糜分离到的5株乳酸菌中产酸能力、抑菌能力均较强的2株，在0.1%胆盐条件下，处理2 h后存活率分别为37%和36.23%；在0.2%浓度下，存活率为0.24%和0.005%；而在0.3%浓度时，存活率均不超过0.01%，这与本试验的结果相似。

3.4 胃蛋白酶耐受性 江志杰等（2005）选择双歧杆菌，在含5 mg/mL胃蛋白酶的PBS培养基（pH=3）作用120 min后，有3株菌其活菌数均高达108CFU/mL，存活率在80%以上，其余3株活菌数则小于108CFU/mL。对照本试验结果，从活菌数上来看，这9株菌的耐消化道能力与上述菌相比更有优势，很够很好地抵抗酶的水解作用。

3.5 抑菌性试验 通过耐消化道环境的筛选，结合存活率和活菌数，本试验筛选得到的4株乳酸菌对大肠杆菌均有明显的抑制作用。刘文华等（2008）研究乳酸菌对大肠杆菌形成的抑菌圈直径为16 mm，与本试验的结果基本一致。张素辉等（2007）试验表明，从仔猪粪便分离到的乳酸菌对大肠杆菌有较明显的抑制作用，温建新等（2008）对附着在鸡盲肠上的乳酸菌分离，通过抑菌试验，对禽致病性大肠杆菌表现出一定的拮抗作用。一般认为乳酸菌抗菌作用主要是通过产生有机酸、H2O2以及细菌素等物质实现。

4 小结

M5、M7、SB1和Z4对盐酸、牛胆盐及胃蛋白酶的综合耐受能力较好，在pH 2.0作用2 h后存活率分别为 39.24% 、28.08%、44.20%、23.28%；在含0.1%牛胆盐MRS液体培养基中培养 2 h后存活率依次为 44.18%、70.31%、32.92%、29.86%；它们对胃蛋白酶也有很好的耐受能力，处理后存活率均超过30%，活菌数可达到108CFU/mL以上。从耐受性的综合评定上看，分离于盲肠食糜的乳酸菌要优于其他肠段分离的，而且也好于分离自同肠段肠道壁的。4株菌对弱毒性大肠杆菌的抑制作用强于普通大肠杆菌，抑菌直径在16～21 mm。

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