肺癌组织中α1,3 FUCTⅦmRNA的表达及其与转移的关系

沈 庆,李 华,兰四友,蒋幼凡,熊 刚

(1.重庆市第三人民医院呼吸内科 400014;2.重庆医科大学第二附属医院呼吸内科 400010;3.第三军医大学西南医院心胸外科,重庆400038)

α1,3FUCTⅦ是一种糖链加工酶,能催化岩藻糖基转移到糖蛋白糖链底物,它是产生Slex(又称为唾液酸化的路易斯-X)的重要物质,大量文献报道,Slex在大肠癌、胃癌、膀胱癌等肿瘤组织中呈明显增强表达[1-3],并与肿瘤的发生、发展、侵袭、转移和预后密切相关。但α1,3FUCTⅦ与肿瘤转移的关系尚不十分清楚。本研究应用 RT-PCR法检测α1,3FUCTⅦ基因mRNA在肺癌组织、癌旁正常肺组织中的表达,探讨α1,3FUCTⅦ基因mRNA的表达与临床病理因素的关系,以及其在肺癌发展过程中可能的作用。

1 材料与方法

1.1 标本 收集本院及协作单位2008年6月至2009年6月期间手术切除肺癌新鲜标本92例(男52例,女40例),患者平均年龄(54±17)岁。其中腺癌36例,鳞癌30例,小细胞癌26例。癌旁正常肺组织选择远离癌组织(＞5 cm)的正常支气管黏膜和肺组织20例作为对照观察。所有标本投入液氮速冻之后,3 h内转移至-80℃低温冰箱冻存。

1.2 试剂 Rever Tre Ace-a-逆转录试剂盒购自TOYOBO公司,PCR System 9700购自 Applied Biosy Stems公司,PCR Mix Taq购自天跟公司。

1.3 RT-PCR法 取标本 20～100 mg,以 TRNzol试剂提取总RNA。将2μg RNA置于 10μL逆转录反应体系中逆转录为cDNA,再行 PCR扩增。根据已知α1,3FUCT Ⅶ基因序列由上海生物技术有限公司合成引物,上游:5′-CCC CGC AG CAA GTC TAT GA-3′,下游:5′-CCA CCC CTG CTT CCT GAC CT-3′(181 bp)。 GAPDH(内参照)引物上游:5′-TG GGG TGA TGC TGG TGC TGA GT-3′,下游:5′-AG GTT TCT CCA GGCGGC ATG TC-3′(500 bp)。PCR反应条件94℃预变性10 min;94℃变性45 s,63℃退火1 min,72℃延伸1 min。35个循环;72℃终延伸10 min。扩增产物10 g/TBE琼脂糖凝胶电泳。溴化乙锭显影,凝胶成像系统(UVITec公司)成像。Image-Pro Plus6.0软件行半定量分析目的基因的相对表达量以目的条带积分光密度(IOD)值与内参照条带IOD值的比值表示。

1.4 统计学方法 采用SPSS12.0统计学软件进行数据处理,所得数据以±s表示,两组均数的比较采用t检验,两组以上均数的比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

α1,3FUCTⅦ基因mRNA在肺癌组织中的表达(表 1,图1、2)。α1,3FUCT Ⅶ基因 m RNA在肺癌组织中表达量为(0.67±0.15),在癌旁正常肺组织表达量为(0.45±0.11),差异有统计学意义(P＜0.05)。其中在腺癌组织(0.79±0.19)中表达最强,小细胞肺癌组织(0.68±0.17)中表达次之,鳞癌组织中表达(0.51±0.12)最弱,差异有统计学意义(P＜0.05)。实验中发现,α1,3FUCTⅦ基因 mRNA在鳞癌组织中表达与癌旁正常肺组织表达差异无统计学意义(P＞0.05)。此外,α1,3FUCT Ⅶ基因mRNA表达与年龄、性别无关(P＞0.05)。与TNM分期、分化程度、淋巴结转移、组织学类型有关(P＜0.05)。

表1 α1,3 FUCTⅦm RNA的表达与肺癌临床和病理学特征的关系

图1 α1,3 FUCTⅦmRNA在癌旁正常组织及鳞癌组织中的表达

图2 α1,3 FUCTⅦmRNA在腺癌组织及小细胞肺癌组织中的表达

3 讨 论

FUCT是一类负责将GDP岩藻糖中的岩藻糖基(Fucose)转移至N-乙酰氨基乳糖单链(GlcNAc)上并以α-岩藻糖苷键相连接的酶。其主要作用底物是糖蛋白的O-糖或乳糖系、新乳糖系的糖脂,也可以是N-糖链,产物主要是含有α-岩藻糖基的血型抗原,如A、B、O血型抗原和 Lewis糖链抗原(Le)。FUCTⅦ是岩藻糖基转移酶(fucosyltransferase,FUCT)的一个亚型,它是Ⅱ类跨膜拓扑结构,N端有14个氨基酸位于细胞质,接着为19个氨基酸的疏水跨膜区以及位于高尔基体内的309个氨基酸催化结构域。1994年 Sasaki等[4]在 THP-C细胞cDNA文库中将其克隆出来。其cDNA全长为1.7 kb,开放阅读框架编码 342个氨基酸,相对分子质量为39.2×103,基因定位在染色体9q34.3。目前的研究发现,岩藻糖基化参与多种生物学过程,包括组织生长、血管生成、细胞增殖、黏附、侵袭和肿瘤转移。至少有18种人基因疾病起因于N-糖基化蛋白改变[5-7]。Prorok等[8]的研究显示:高亲和力的选择素和其配体的相互作用需要core2基础的0聚糖,它的合成需要岩藻糖转移酶Ⅶ(FUCTⅦ)和磺基转移酶,以core1前提为底物进行修饰,最终形成侧链为 Slex的core2基础的 0聚糖。而FUCTⅦ及其产物Slex对肝癌细胞H7721的转移能力起至关重要的作用[9]。

众所周知,α岩藻糖转移酶大家族目前已发现有9种亚型,其中FUCT-Ⅲ(Lewis血型,Le)主要分布在肾、胆囊及乳汁中。FUCT-Ⅳ(类髓型)产物为Lex及ⅥM-2,存在于 5～10周胚胎各组织,在成人仅在髓系组织及大脑中表达。FUCT-Ⅵ(血浆型)主要存在于肝脏和血浆,其产物为Lex和Slex。其中FUCT-Ⅵ催化合成Slex的能力可以是FUCTⅦ的1.5倍[10]。FUCTⅦ(白细胞型)在白细胞中表达,只能以唾液酸化的糖链为底物,合成Slex[11]。前期的研究发现,FUCTⅦ的活性可以直接影响Slex的表达量并进而影响肝癌细胞的黏附、趋化性迁移和侵袭等转移表型[12]。用佛波脂(TPA,一种促癌剂,也是PKC蛋白激酶激活剂)处理Jurkat细胞观察FUCTⅦ及其产物Slex表达的改变,结果发现处理后的细胞增加FUCTⅦ的转录及其产物Slex的表达,并能诱导合成 E-选择素配体合成[13]。

本文研究发现,α1,3FUCTⅦ基因m RNA在肺癌组织中表达量明显高于癌旁正常组织,其中在腺癌组织表现最强。而且α1,3FUCTⅦ基因mRNA表达与 TNM 分期、分化程度、淋巴结转移、组织学类型有关,与年龄、性别无关。表明α1,3FUCTⅦ基因mRNA表达可能与肺癌的发生及转移相关。

然而,本实验仅限于对肺癌组织标本中α1,3FUCTⅦ基因m RNA进行研究,验证其与临床病理因素的关系,至于α1,3FUCTⅦmRNA在肺癌中的作用机制尚未涉及,肺癌组织中的Lewis抗原与α1,3FUCTⅦmRNA关系如何尚不清楚。因此,还需要进一步研究在肺癌组织中Lewis抗原与其合成酶FUCT之间的关系,并结合相关细胞系及临床结果来证实这种Lewis抗原及相关的糖链加工酶是否能成为肿瘤转移的新的生物学指标和防止肿瘤转移可能的治疗靶点。

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