泌尿生殖道沙眼衣原体对大环内酯类药物的体外药敏研究

杨丽娜，江勇，刘全忠

（1.天津医科大学总医院，天津300052；2.天津医科大学第二医院，天津 300211）

泌尿生殖道沙眼衣原体对大环内酯类药物的体外药敏研究

杨丽娜1，2，江勇2，刘全忠1

（1.天津医科大学总医院，天津300052；2.天津医科大学第二医院，天津 300211）

目的 研究红霉素、阿奇霉素、克拉霉素三种大环内酯类药物对泌尿生殖道沙眼衣原体体外药敏试验，评价药敏结果和临床疗效的关系，以指导临床用药。方法 采用细胞培养和碘染包涵体计数的方法，将采集到的符合要求的237株临床株进行细胞传代培养，并对其中52株感染率达90%以上的标本进行3种大环内酯类的药敏试验。结果 共培养出沙眼衣原体82株，阳性率为34.60%。感染率达90%的52株药敏结果（MIC）分别为红霉素0.25～ 2μg/mL，阿奇霉素0.063～1.000μg/mL，克拉霉素0.004～0.064μg/mL。结论 共发现13株红霉素耐药株，未发现对其他2种抗菌药耐药的菌株，但阿奇霉素MIC较以前报道升高。

沙眼衣原体；大环内酯类；药敏试验

Abstract：ObjectiveTo evaluate the activities of three macrolides agianst Chlamydia trachomatis（CT）by antimicrobial susceptibility testing.MethodsCell culture and iodine staining of chlamydia inclusions were used to culture 237 clinical samples and to determine MICs of three macrolides against 52 samples which infection rate was beyond 90%.Results82 strains out of 237 clinic isolates were postive for CT,the postive rate was 34.60%.The MICs of Erythromycin,Azithromycin and Clarithromycin,the three macrolides against 52 samples were 0.25～2ug/ml,0.063～1.000ug/ml,0.004～0.064ug/ml,respectively.Conclusion13 strains were found resistant to Erythromycin,none resistant strain was found to Azithromycin and Clarithromycin.But the MIC of Azithromycin was higher than before.

Key words：Chlamydia trachomatis；macrolides；drug sensitive test

沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，CT）是一种严格的细胞内寄生菌，所致的泌尿生殖道感染在发达国家和某些地区已成为最常见的性传播疾病。在我国其发病率于2001年也位于8种性病之首[1]。研究报道它还是人类免疫缺陷病毒（HIV）和女性宫颈癌有关。大环内酯类药物在治疗CT感染时比较常用，且阿奇霉素是美国疾病防治中心推荐治疗性病沙眼衣原体的一线药物[2]。随着其在临床上的广泛应用，目前临床上治疗失败的报道愈来愈多，有关其耐药的报道也逐年上升。为了了解CT对大环内酯类的耐药情况，我们对临床常用的红霉素、阿奇霉素和克拉霉素进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本共收集2005年—2009年期间到天津市性传播疾病研究所门诊就诊患者的尿道或宫颈拭子237例，标本经直接免疫荧光法镜下检测到CT，且标本淋球菌、支原体检查阴性；所有患者取材前均停用任何抗菌药物两周以上。菌株经过McCoy细胞培养和碘染色鉴定，放于-80℃冰箱中保存。

1.1.2 抗菌药及工作液的配制 红霉素 (850μg/mg)自美国Sigma公司，克拉霉素(972 U/mg)、阿奇霉素(936 U/mg)购自中国药品生物制品检定所。根据药物溶解性不同分别把3种抗菌药配制成高浓度的贮存液，然后用无抗感染液稀释成一定浓度的工作液。市性传播疾病研究所细胞培养室保存。

1.2 方法

1.2.1 CT培养应用McCoy细胞培养法，对临床采集的标本接种传代培养，碘染镜下观察结果。对阳性标本继续传代培养至感染率达90%以上，收集标本分装置于-80℃冰箱保存备用。

1.2.2 药物敏感性测定方法

1.2.2.1 接种量的确定 先确定能引起90%以上细胞感染的CT的接种量。

1.2.2.2 最低抑菌浓度（MIC）的测定 每个实验设立阴性对照（加药物，但不接种CT)和阳性对照(接种CT，但不加药)。抗菌工作浓度参照文献[2-4]，并以文献推荐浓度为中间浓度，设6个等比稀释浓度。首先在96孔板中制备致密单层细胞每孔（1～2）×105细胞。根据已确定的接种量接种CT，32℃，3 000r/min，离心1 h后置于37℃、5%CO2温箱孵2h。然后弃液，加入无抗感染液及配制好的相应的待测抗菌药工作液，依次倍比稀释，使抗菌药形成不同浓度。然后同前条件孵育44～48 h左右，孔板风干固定后，经碘染色镜下观察结果。镜下观察未见有CT包涵体的最小稀释浓度即为测试药MIC。

1.2.2.3 药敏结果的判定标准 目前国内外对CT体外药敏结果的判定尚无公认且统一的标准。本实验参照细菌标准，采用三级划分制，高度敏感：MIC显著低于常规用药时血药浓度和组织浓度；中度敏感：MIC等于常规用药时血药浓度和组织浓度。耐药：MIC高于常规用药时血药浓度和组织浓度。3种抗菌药物的血药浓度分别为：红霉素0.3～0.7μg/mL、克拉霉素1.0μg/mL、阿奇霉素0.4～0.45μg/mL。

2 结果

经传代培养237例临床标本共获得82株培养阳性CT，阳性率为34.60%。对其中52株感染率超过90%的进行体外药敏试验，药敏MIC结果分别为0.25～2μg/mL,阿奇霉素0.063～1.000μg/mL，克拉霉素0.004～0.064μg/mL,见表1。共发现13株红霉素耐药株(MIC>1μg/mL，且≤2μg/mL，MIC值超过血药浓度和组织药物浓度)，未发现对其他2种抗菌药耐药的菌株。

表1 3种大环内酯类抗菌药对沙眼衣原体临床株的体外药敏结果

3 讨论

本次研究显示，大环内酯类药物按MIC值由高到低的顺序排列依次是红霉素、阿奇霉素、克拉霉素。

研究测得红霉素MIC值0.25～2g/mL，与韩建德等[3]报道的MIC为1.0～2.0μg/mL，研究结果相近，但与以往报道[4]相比，我们的实验结果表明红霉素的敏感性显著降低，且发现13例红霉素耐药菌株，耐药株所占比例较高(25%)，表明天津地区已出现红霉素耐药菌株，提示红霉素已不适合泌尿生殖道CT感染的一线治疗，需引起临床工作者的高度重视。沙眼衣原体在体外显示的是一种“异形耐药”[5]，即沙眼衣原体包括敏感群体和耐药群体。红霉素的研究进步证实了这一点，在MIC值显示耐药的情况下，我们可以发现少量的包涵体，有时仅为一、二个包涵体。说明只有这一小部分对红霉素耐药。而红霉素耐药患者在使用红霉素治疗后，虽不能治愈，但是可以获得临床症状的缓解，进步证实“异形耐药”。回顾患者的临床资料，部分患者就诊后未曾使用过红霉素治疗，而就诊前有的患者已在院外使用过红霉素，有的患者未用过因此考虑红霉素耐药株中既有原发耐药又有获得性耐药。

阿奇霉素是新的大环内酯类药物，对CT具有较低抑菌、杀菌浓度。有效血药浓度为0.4～0.45μg/mL。美国CDC推荐阿奇霉素1g单次口服治疗衣原体感染时有效的，但是在3个月内大约有15%～20%的患者持续感染或复发，4个月的临床治愈只有65%～75%[6,7]。而我们在治疗1个月后的阴转率只有44.44%[8]，明显低于国外报道。研究测得阿奇霉素的MIC值为0.25～1.0μg/mL，与韩建德等[3]报告的0.125～0.5μg/mL相比，敏感程度有所下降，而且其中40株菌株(76.92%)测定值已经超过血药浓度。虽然研究未发现阿奇霉素耐药菌株，但是阿奇霉素耐药趋势明显，不适合推荐作为治疗泌尿生殖道CT感染的首先药物。

研究测得克拉霉素MIC 0.004～0.032μg/mL，与文献报道[3]相当，且抑菌浓度低，提示有较强的抗CT活性。其中1例红霉素耐药患者，使用其他种类抗菌药物治疗后复查支原体仍阳性，后来改用克拉霉素治疗复查支原体转阴，说明克拉霉素可试用于对红霉素耐药的菌株和顽固性病例的治疗。临床治疗失败与体外实验耐药之间相差较大[9]。虽然临床上报道阿奇霉素和克拉霉素治疗失败病例，但在体外药敏实验并未分离到的耐药株。可能的原因：①临床治疗失败是由临床上持续感染状态引起，并未形成耐药；②细胞传代培养可能导致耐药质粒的丢失且体内外环境存在较大差异。

［1］龚向东，叶顺章，张君炎，等．1991～2001年我国性病流行病学分析[J]．中华皮肤科杂志，2002，35(3)：178-l82．

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［5］Somani J,Bhullar VB,Workowski KA,et al．Multiple drug-resistant Chlamydia trachomatis associated with clinical treatment failure[J].J InfectDis,2000,181:1421-1427．

［6］Stamm WE.Chlamydia trachomatis—the persistent pathogen: Thomas Parran Award Lecture[J].Sex Transm Dis,2001,28: 684-689.

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［9］尚淑贤，王千秋．沙眼衣原体抗生素敏感性试验及临床耐药研究[J]．中华皮肤科杂志，2003,36（9）：540-542．

In Vitro Activities of Macrolides Against Chlamydia Trachomatis

YANG li-na1，2,JIANG Yong2,LIU Quan-zhong1
1.Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin 300052,China;2.The Second Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin300211,China

R374+.1

B

1672－0709（2010）05-0298－02

2010-06-30)

国家自然科学基金（30671879）

刘全忠，Email：liuquanzhong@medmail.com.cn

杨丽娜：现在天津医科大学第二医院工作