响应面法优化采油菌株Bacillus FH-1-2产脂肽发酵培养基

王 建 伟，孙 玉 梅，曹 芳，王 培 忠

( 大连工业大学 生物与食品工程学院， 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

生物表面活性剂是微生物在一定条件下产生的集亲水性和亲油性结构于一体的代谢产物[1]，它能降低油水界面张力并乳化原油，从而提高石油采收率[2]。生物表面活性剂主要包括糖脂和脂肽，脂肽是由β-氨基或β-羟基长链脂肪酸和环肽构成[3]。

临界胶束浓度与脂肽含量具有线性关系[4]。利用表面张力法测定临界胶束浓度，可以简单、快速地反映脂肽含量和表面张力值的关系。表面张力测定方法主要有表面张力法、界面张力法、血平板法、原油平板法、液滴法和傅里叶变换红外光谱法。血平板法的缺点是如果血平板制作不好则不易发现溶血圈，直接影响到实验结果的观察；原油平板法只适合能利用石油烃类物质产生生物表面活性剂的微生物；液滴法需要的样品数量过多[5]。

响应面法是一种优化过程的综合技术，具有试验次数少、结果准确等优点，是降低开发成本、优化生产条件、提高产量的一种有效方法，已经广泛地应用于培养基优化研究。已有人采用响应面法利用血平板测定脂肽含量[6]。

采油菌株BacillusFH-1-2能够产生脂肽类生物表面活性剂，本文通过表面张力表征菌株发酵所产脂肽含量，并采用响应面分析法对其产脂肽培养基进行优化，以期为脂肽增产促进原油采收提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌 种

菌种BacillusFH-1-2，辽河油田丰华应用技术综合厂提供。

1.2 培养基

斜面培养基(g/L)：NaCl 5，牛肉膏 5，蛋白胨 10，琼脂 20，pH 7.0。

LB种子培养基(g/L)：NaCl 5，牛肉膏 5，蛋白胨 10，pH 7.0。

发酵培养基(g/L)：KH2PO43.4，Na2HPO41.5，NaNO34，MgSO4·7H2O 0.7，酵母粉0.2，液蜡25，pH 7.0[7]。

以上培养基均于121 ℃灭菌20 min。

1.3 菌体培养

菌种保存及活化：BacillusFH-1-2菌株在4 ℃保存于琼脂斜面并每3个月转接。取保存菌株接种于LB琼脂斜面，30 ℃活化培养36 h。

种子液制备：从斜面取2环菌体接入100 mL种子培养基中(250 mL三角瓶)，于30 ℃、150 r/min摇床培养24 h。

发酵液制备：于100 mL发酵培养基中(250 mL三角瓶)接种5%(体积分数)种子培养液，30 ℃、150 r/min摇床培养48 h。移除发酵液上层油相，于3 000g离心20 min，收集上清液。

1.4 表面张力(γ)测定

采用环形表面张力仪(承德大华试验机有限公司)测定发酵上清液表面张力。

1.5 脂肽表面活性剂纯品制备

将发酵上清液与氯仿甲醇溶液(体积比为1∶1)等体积混合，萃取3次(分液漏斗)合并有机相。取下层氯仿相离心得到表面活性剂粗品，用正己烷洗涤表面活性剂粗品除去有机酸，萃取后离心得表面活性剂纯品，于60 ℃烘干[8]。

所有实验结果均通过3次平行实验获得。

2 结果与分析

2.1 脂肽浓度与表面张力的关系

测定0～900 mg/L脂肽表面活性剂纯品溶液的表面张力。由图1可知，脂肽溶液的表面张力随脂肽浓度增大逐渐降低，当脂肽溶液的表面张力降至34.1 mN/m后，表面张力不再随脂肽浓度的增大而降低，基本保持不变，此时对应的脂肽质量浓度500 mg/L即为临界胶束浓度。

图1 表面张力与脂肽质量浓度关系图

Fig.1 The relation of surface tension and lipopeptide concentration

对0～500 mg/L脂肽溶液质量浓度与表面张力进行线性回归，得线性回归方程：y=-0.073 8x+71.257，线性相关系数R2=0.996。可见脂肽质量浓度与表面张力有良好的线性关系，可以通过表面张力表示脂肽含量[4]。

2.2 Plackett-Burman试验设计

在文献[7]的培养基基础上加入了FeSO4、MnSO4。采用N=12的Plackett-Burman试验设计分析KH2PO4、Na2HPO4、NaNO3、酵母粉、MgSO4·7H2O、MnSO4、FeSO4、液体石蜡8个因素对脂肽产量的影响。因为不同组分配比的发酵液初始表面张力(γ)均不相同，本文以Δγ为响应值进行响应面分析[9]，Δγ=γ1-γ2(γ1为发酵初始发酵液的表面张力值，γ2为发酵48 h后发酵液的表面张力值)。试验设计与结果见表1，利用Minitab软件对Plackett-Burman试验的各因素的分析结果见表2。由表2的分析结果可知FeSO4、MnSO4和酵母粉对Δγ影响显著，MnSO4、酵母粉为正效应，应增加，FeSO4为负效应，应减少。FeSO4、MnSO4和酵母粉3个因素的可信度均在90%以上，因此以这3个因素作为主要影响因素进行下一步研究。

2.3 最陡爬坡试验

设定FeSO4的步长为0.003 g/L，MnSO4步长为0.1 g/L，酵母粉的步长为0.1 g/L，进行最陡爬坡试验。由表3可知，第2组的响应值最大，因此以第2组为中心进行下一步试验。

2.4 Box-Behnken试验设计

以FeSO4、MnSO4和酵母粉作为自变量，采用三因素三水平的Box-Behnken响应面分析法对培养基进行优化，试验因素水平见表4，设计见表5，试验结果分析见表6。

表1 Plackett-Burman试验设计(N=12)及响应值表

表2 Plackett-Burman试验因素水平及其主效应分析

表3 最陡爬坡试验设计及结果

表4 Box-Behnken试验因素水平

Tab.4 Experimental variables and levels for Box-Behnken design

因素符号水平-101FeSO4X10.0080.0110.014MnSO4X20.10.20.3酵母粉X30.10.20.3注:X1=(ρ1-0.011)/0.003,X2=(ρ2-0.2)/0.1,X3=(ρ3-0.2)/0.1 (ρx为各物质的质量浓度)。

表5 Box-Behnken试验设计及结果

表6 回归方程系数表

将各系数带入方程：

式中，Y为响应值，β0为截距，βi为线性系数，βij为交互作用系数。得到回归方程：

Y=27-0.137 5X1-0.112 5X2+0.05X3+

0.375X1X3+0.475X2X3

由表7可知，模型在α=0.01水平上回归显著，P=0.311>0.1，失拟不显著，因此模型选择正确。同时，一次项、平方项、交叉项均对响应值有显著性影响，其中复相关系数的平方R2=0.963 1，说明模型可以解释96.31%实验所得脂肽产量的变化，表明方程拟合较好。CV(Y的变异系数)表示实验的精确度，CV值越高，实验的可靠性越低，本实验中CV=3.609 138，较低，说明实验操作可信。回归方程为BacillusFH-1-2发酵产脂肽提供了一个合适的模型。

表7 回归方程的方差分析

2.5 响应面分析及各组分最佳质量浓度的确定

利用回归方程求得各组分最佳质量浓度，并绘制分析图，响应面立体分析图和相应等高图见图2～4。对回归方程求一阶偏导数：

0.137 5-2.4X1-0.55X2-0.375X3=0

(1)

0.112 5-0.55X1-2.9X2+0.475X3=0

(2)

0.05-0.125X1+0.475X2-1.65X3=0

(3)

X1=(ρ1-0.011)/0.003，X2=(ρ2-0.2)/0.1，X3=(ρ3-0.2)/0.1,(X1,X2,X3)的编码值分别为(-0.073 5,0.038 7,0.047)，从编码值可知，FeSO4、MnSO4和酵母粉的最佳质量浓度分别为0.011、0.204、0.205 g/L。

2.6 验证实验

采用优化后的培养基进行发酵实验，测定表面张力值，γ1=(66.7±0.2) mN/m，γ2=(38.4±0.2) mN/m，提取脂肽后测得质量分别为400、411、392 mg/L，均值401 mg/L，与优化值419 mg/L非常接近，与原培养基脂肽产量335 mg/L相比，增产66 mg/L，在原基础上提高了19.7%。

图2 Y=f(X1，X2)响应面立体分析图和相应等高线图

图3 Y=f(X1，X3)响应面立体分析图和相应等高线图

图4 Y=f(X2，X3)响应面立体分析图和相应等高线图

3 结 论

采用响应面分析法对BacillusFH-1-2产脂肽发酵培养基进行优化，运用Plackett-Burman法确定FeSO4、MnSO4和酵母粉为重要影响因素；通过最陡爬坡试验逼近最佳响应面区域；采用Box-Behnken设计得出回归方程，回归方程方差分析显示模型选择正确，方程拟合良好，说明方程可以真实地反映各因素对BacillusFH-1-2产脂肽的影响。优化后的培养基组成(g/L)为：FeSO40.011，MnSO40.204，酵母粉0.205，KH2PO43.4，Na2HPO41.5，NaNO34，MgSO4·7H2O 0.2，液体石蜡。采用优化后的培养基，脂肽产量在原基础上提高19.7%。

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