产胶原蛋白酶枯草芽孢杆菌的筛选

孙 佳 佳，王 红 英，钱 斯 日 古 楞，常 凯

( 大连工业大学 生物与食品工程学院， 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

胶原蛋白酶 (Collagenase，E.C 3.4.24.3)是作用于胶原或其变性明胶而不作用其他蛋白质的酶类。它来源广泛，多种微生物以及动物的许多组织细胞都可以产生胶原蛋白酶[1]。目前已发现溶组织梭菌、溶藻弧菌等微生物能产生胶原蛋白酶，并不断发现新的产胶原蛋白酶的微生物[2]。

枯草芽孢杆菌生境多样，可利用的营养物质种类十分丰富，这决定了其具有丰富的产酶系统，具备生产多种酶的应用潜力[3]。研究表明，枯草芽孢杆菌能够产生蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶和木聚糖酶等十几种酶[4]。近年来，对枯草芽孢杆菌的研究已渐进到遗传学与微生物学领域[5]，但由枯草芽孢杆菌提取出胶原蛋白酶的文章还未见报道。本实验以海产品市场附近的污泥为样品，筛选新的高产胶原蛋白酶的微生物，并对其进行初步鉴定。

1 材料与方法

1.1 材 料

样品，采自大连市海产品批发市场附近的污泥。

主要试剂：胶原蛋白粉末，本实验室自制；酪蛋白，金铂铱科技有限公司。

1.2 产胶原蛋白酶菌的筛选

1.2.1 培养基

富集培养基(100 mL)：胶原蛋白 10 g，酵母膏 0.01 g。

明胶培养基(100 mL)：明胶 2.0 g，蛋白胨 0.5 g，KH2PO40.05 g，MgSO4·7H2O 0.02 g，NaCl 0.01 g，pH 7.2～7.5，琼脂1.5 g。

1.2.2 富集培养

取污泥10 g置于三角瓶中，加100 mL富集培养基。在32 ℃摇床培养48 h后过滤，取滤液。

1.2.3 初 筛

将滤液稀释，分别在10-1～10-8下各取1 mL于明胶培养基用稀释涂布法在平皿上将菌液涂匀，28 ℃条件下培养48 h，选择生长良好、形态明显并有透明圈菌落的平皿。

1.2.4 复 筛

将培养较好的平皿中的菌落点种到明胶培养基上，28 ℃条件下培养48 h后，挑选出培养基上产生透明圈明显的单菌落。将此单菌落在明胶培养基上重复培养5次，菌落生长状态稳定，由此证明它的菌株传代稳定性好。

1.2.5 菌种的确定

菌落形态观察参考《伯杰氏鉴定手册》及相关生物实验教程。各项生理生化指标采用细菌鉴定常规方法。

通过对初步筛选出的菌种进行甲基红(MR)、革兰氏染色、明胶液化实验等菌种的生理生化实验，来确定能够产胶原蛋白酶的菌种。

1.3 胶原蛋白酶的提取及酶活的测定

1.3.1 提 取

将通过生理生化实验筛选出的菌种，在明胶液体培养基上，32 ℃条件下培养48 h。然后将培养液4 000 r/min离心10 min，取上清液。冰浴条件下，在上清液中缓慢加入硫酸铵至终质量分数为70%。4 ℃静置过夜后，8 000 r/min离心15 min，收集沉淀，沉淀溶解到pH 7.5缓冲溶液中，透析24 h后冰箱保存备用。

1.3.2 酶活测定

取1支试管，加入2.0 mL 0.5%的酪蛋白溶液，于30 ℃水浴中预热5 min，再加入1.0 mL已预热好的枯草杆菌蛋白酶液，水浴中准确保温10 min后，立即加入3.0 mL的10%三氯醋酸溶液，摇匀静置15 min，过滤，收集的即是样品的滤液。另取一试管，先加入1.0 mL酶液和3.0 mL的10%三氯醋酸溶液，再加入2.0 mL 0.5%的酪蛋白溶液，混匀后于30 ℃水浴保温10 min，过滤，收集滤液作为对照溶液。

另取3支试管，分别加入1 mL样品滤液、对照滤液和水，然后各加入5 mL 0.55 mol/L 碳酸钠溶液和1 mL Folin-酚试剂，摇匀后在30 ℃下显色15 min，在680 nm处测吸光值。以酪氨酸为标准制作标准曲线。

酶活力(U)=(A样-A对)×K×N×V/t

式中，A样为样品液吸光度值；A对为对照液吸光度值；K为吸光度值1对应的酪氨酸微克数；t为酶促反应时间；N为酶液稀释倍数(本实验N为1)；V为酶促反应总体积。

酶活力单位定义：在30 ℃、pH为7.5的条件下，1 mL酶液每分钟水解胶原蛋白产生相当于1 μmol酪氨酸的酶量为1个酶活力单位(U)，即1 mL枯草杆菌蛋白酶液所具有的活性。

1.4 胶原蛋白酶法转化及产物

将胶原蛋白溶液与酶液，按体积比1∶0.5、1∶1和1∶2各配置3份，在37 ℃条件下分别反应4、8和24 h。采用SDS-PAGE凝胶电泳测定胶原蛋白酶水解情况及产物分子质量分布范围。

2 结果与讨论

2.1 胶原蛋白酶产生菌的筛选

2.1.1 分离纯化

通过初步筛选在10-5梯度下获得3个菌种，利用划线分离法分别对其进行分离纯化以获得单个菌种，结果如图1所示。

图1 菌种图片

2.1.2 菌种的确定

为了确定筛选的3个菌种是否为最后所需菌种，对其进行生理生化鉴定，结果如表1所示。由表1可以看出，②号菌的明胶液化实验为阳性，说明它所产生的酶能够使明胶液化，即能够水解明胶，所以确定它为所需菌种。

将②号菌种通过显微镜观察，其细胞呈直杆状，大小(0.8～1.2) μm×(1.5～4.0) μm，单个，革兰氏染色阳性，着色均匀，产荚膜，周生鞭毛；芽孢中生或近中生，小于或等于细胞宽。

通过进一步的生理生化实验发现，②号具有以下特性：专性好氧，不具凝乳作用，过氧化氢酶实验、硝酸盐还原实验、V-P实验阳性；苯丙氨酸脱氢酶实验、卵黄卵磷脂酶实验阴性；分解葡萄糖产酸不产气，能分解阿拉伯糖、甘露醇、酪素、明胶淀粉。

利用电镜观察，椭圆形，不明显膨胀，低凸起，表面皱褶。

通过以上实验可以看出，②号菌种具有典型的芽孢杆菌特征，由此可以确定筛选出的菌种为枯草芽孢杆菌。

表1 筛选菌种的生理生化特性

2.2 酶活力的测定

将②号菌经过明胶液体培养基培养48 h，提取它所产生的胶原蛋白酶并测其酶活。测得A样=0.296，A对=0.026。计算得，酶活力(U)=44.982 U/mL

由于是粗酶液，含有其他酶类且稀释度较大，所以酶活力较小。

2.3 胶原蛋白酶转化及其产物

将胶原蛋白溶液与酶液按比例混合，在一定条件下反应。采用SDS-PAGE凝胶电泳测定胶原蛋白酶解情况及产物分子质量范围。

1，胶原蛋白；2，底物与酶1∶2体积比混合反应8 h后的反应液；3，标准Marker，肌球蛋白200 ku；β半乳糖苷酶116 ku；磷酸酶b 97.2 ku；牛血清蛋白66.4 ku;碳酸苷酶29 ku;胰蛋白酶抑制剂20.1 ku;抑肽酶6.5 ku

图2 SDS-PAGE电泳图

Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis picture

由电泳结果可知，筛选出的枯草杆菌能够产胶原蛋白酶并能水解胶原蛋白。

3 结 论

实验结果表明，以海产品市场附近采集的污泥为样品，经过富集培养基培养48 h后在10-5的稀释度下利用明胶培养基筛选出能够产胶原蛋白酶的菌种，并且菌种传代稳定性非常高。通过生理生化实验和电镜观察，确定筛选出的菌种为枯草芽孢杆菌。对其产的胶原蛋白酶进行分离和活力测定，得到的酶活力为44.982 U/mL。电泳结果证明，筛选出的枯草芽孢杆菌能够产胶原蛋白酶，在底物与酶1∶2体积比混合反应8 h后，能够使分子质量为100 ku左右的胶原蛋白水解成8 ku左右的短肽。

[1] 李文俊,郭晓奎,姜叙诚. 微生物胶原酶[J]. 微生物学杂志, 2004, 24(2):32-38.

[2] 张娟,刘书亮,吴琦,等. 产弹性蛋白酶芽孢杆菌的筛选与鉴定[J]. 四川农业大学学报, 2007, 25(3):253-261.

[3] 惠明,窦丽娜,田青,等. 枯草芽孢杆菌的应用研究进展[J]. 安徽农业科学, 2008, 36(27):11623-11624,11627.

[4] MAURIELLO E M F, DUC L H, ISTICATO R, et al. Display of heterologous antigens on the Bacillus subtilis spore coat using CotC as a fusion partner[J]. Vaccine, 2004, 22:1177-1187.

[5] MARCUS S, AJAY S, OWEN P W. Developments in the use of Bacillus species for Industrial production[J]. Canadian Journal of Microbiology, 2004, 50(1):1-17.