载荷bFGF-PLGA微球的胶原海绵的制备及其体外缓释性能研究

武继民，汪鹏飞，李志宏，刘永清，袁晓燕

(1. 天津大学材料科学与工程学院，天津 300072；2. 军事医学科学院卫生装备研究所，天津 300161)

碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factors，bFGF)是一种具有广谱作用的促进组织或血管形成生长因子[1-2]．bFGF与其他生长因子一样，在细胞外基质(ECM)中它是联结细胞行为的专一信号因子，在创伤愈合中起到促血管化的主要作用 ，因此bFGF及其制剂的相关应用研究一直是组织工程支架材料、再生医学及创伤治疗领域最活跃的课题之一．但是，bFGF作为一种碱性多肽[5]，在体内扩散快、对热和酸敏感、易被蛋白酶分解、半衰期短，因此其生物学效应不能得到充分发挥．如何有效地发挥 bFGF的生物学效应制约着 bFGF的进一步体内应用研究，药剂学的缓释技术较好地解决了这个问题．通过微球包埋，使 bFGF与外界的酶解环境相对隔离，能够在相当长的时间内缓释药物并使局部药物浓度维持在一个相当的水平．

通过溶剂挥发法，以bFGF为药物、PLGA为高分子载体材料制备 bFGF-PLGA微球，对 bFGF进行控释释放研究，取得了较好的实验结果[5-6]．但是，药物的微球缓释技术虽然具有很大的开发潜力，却仍存在很多问题．其中药物体外释放过程中的突释问题就是制约微球制剂临床应用的一个重要因素．胶原作为一种比较理想的天然载体材料，具备作为活性因子载体的基本条件，尤其是胶原海绵在作为组织工程支架或创伤敷料方面颇具优势[7]．笔者通过 bFGFPLGA微球与胶原基质的复合，制备载有 bFGFPLGA微球的胶原海绵，将 bFGF-PLGA微球包埋在胶原海绵表面和内部结构当中，能够很好地解决药物释放过程中的突释问题，同时胶原基质与 bFGF具有生物学上的协同作用，二者结合能够更好地发挥其生物学作用[8]．

1 材料和方法

1.1 试剂与设备

1.1.1 主要试剂

重组人的碱性成纤维细胞生长因子 rh bFGF，70,000,Au/支，北京双鹭生物制药有限公司．bFGF标准品，9,800,IU/mL，中国药品生物制品检定所．胶原，本实验室自制．乳酸-羟基乙酸共聚物 poly(lactic-coglycolic acid)，PLGA(75/25)，相对分子质量 5.0×104，山东医疗器械研究所．聚乙烯醇 PVA，纯度96%～98%，水解度 98%，聚合度 1,750±50，中国医药集团上海化学试剂公司．酶联吸附免疫法 ELISA试剂盒，Sigma公司．二氯甲烷等其他试剂均为分析纯．

1.1.2 主要设备

JSM-6700F型场发射扫描电镜(日本)．X-520型高速匀浆机(美国)．78-1型磁力加热搅拌器(江苏金坛市富华电器厂)．CR22G型超速冷冻离心机(日本)．Freezone6型真空冷冻干燥机(美国)．DH4000A型隔水式电热恒温培养箱(天津泰斯特医疗器械厂)．SHACA型水浴恒温振荡器(江苏金坛市医疗仪器厂)．MULTISKAN MK3全自动多功能酶标仪(美国)．

1.2 方法

1.2.1 bFGF-PLGA微球和载荷微球胶原海绵的制备

采用溶剂挥发法制备包埋 bFGF的 PLGA微球．将水溶性的 bFGF溶于生理盐水中作为内水相(W1)，PLGA 溶于二氯甲烷中作为油相(O)，2%的PVA水溶液作为外水相(W2)．(W1/O/W2的体积比为15∶2∶50，油相中 PLGA 浓度 10,mg/mL，)．将 W1逐滴滴入O中，以高速匀浆机在30,000,r/min下乳化1,min形成初乳(W1/O)；待初乳稳定后，将初乳液滴入一定体积不同浓度的 PVA水溶液中(W2)，15,000,r/min下搅拌3,min形成复乳(W1/O/W2)．然后将复乳液倒入烧杯中，室温下磁力搅拌挥发 3～5,h，过滤，3,500～5,000,r/min离心 15～20,min，去离子水洗涤、过滤后再离心，如此反复操作 3～5遍，直至将多于的PVA清除．将样品-20,℃冷冻保存至少48,h；冷冻干燥24,h，收集微球粉末待用．

精确称取定量的 bFGF-PLGA缓释微球，均匀分散于胶原溶液中，将分散好的胶原凝胶置入直径6,cm 厚 5,mm 的模具中，于 4,℃下静置 24,h后，再在-20,℃冷冻 48,h，冷冻干燥 24～36,h，得到载荷bFGF-PLGA微球的胶原海绵．

1.2.2 bFGF-PLGA微球、胶原海绵及载荷微球胶原海绵的形貌观察

制作相应的扫描电镜观察样品，观察表面形态结构，进一步了解微球与胶原海绵的复合情况．

1.2.3 ELISA检测法及绘制标准曲线

采用双抗体夹心ELISA法测试，采用抗人bFGF单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的 bFGF与单抗结合，加入生物素化的抗人 bFGF抗体(二抗)，它将与结合在单抗上的人的 bFGF结合而形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与二抗的生物素结合，加入TMB显色．在450,nm处测其吸光度(OD值)，bFGF浓度与OD值呈正比，可通过绘制标准曲线求出标本中bFGF浓度．

做标准曲线时，要扣除标准品稀释液造成的本底．如果标本用标准品稀释液稀释，也要扣除标准品稀释液造成的本底；如果标本未用标准品稀释液稀释，标本不需扣除标准品稀释液造成的本底．以标准品浓度 600 pg/mL、300 pg/mL、150 pg/mL、75 pg/mL、37.5,pg/mL、18.75,pg/mL、9.38,pg/mL、0,pg/mL 之 OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，建立bFGF的标准曲线并得出标准方程(图略)．然后根据样品 OD值在该曲线图上查出相应bFGF含量．

1.2.4 bFGF-PLGA微球中bFGF的载药量和包封率测定

称取20,mg微球，加入2,mL的二氯甲烷中，使其完全溶解，再加入1,mL 0.1,mol/L PBS缓冲溶液(pH=7.2)，充分搅拌、静置、分液，收集水相冻存，利用ELISA测定样品OD值．根据样品OD值及标准曲线计算待测液中 bFGF的浓度，从而计算出微球中的bFGF含量，即可得微球的载药量和包封率．

1.2.5 微球及载荷微球海绵的体外释药行为测定

精确称取定量微球及载荷微球海绵置于透析袋中，紧密封口，然后置于 20,mL作为缓释介质的 PBS缓冲溶液(pH＝7.2)中，37,℃下以100,r/min的速率恒温恒速振荡．分别在第 1/2,d、1,d、2,d、3,d、5,d、8,d、12,d、17,d、23,d、30,d、35,d、45,d 定时移去 2 mL 释放介质于离心管中标号冻存待测并补充同样体积的新鲜缓冲液．以PBS缓冲溶液为空白对照，ELISA法测吸光度值，检测bFGF浓度．

式中：m1为微球或载荷微球海绵在缓冲液中溶出bFGF的量；m2为微球或载荷微球海绵中 bFGF的总量．

2 结果与讨论

2.1 微球表面形貌

经 SEM 观察，bFGF-PLGA微球表面光滑，球形好，且球呈中空状．胶原海绵内壁平滑，有明显的纤维形态．如图1所示．

图1 bFGF-PLGA微球和胶原海绵的表观形貌SEM图Fig.1 SEM images of morphology of bFGF-loaded PLGA microspheres and collagen sponge

2.2 载荷bFGF-PLGA微球胶原海绵的形貌特征

图 2为不同放大倍数下载荷微球胶原海绵的电镜照片．从图2可以看出，表面呈凸起状，微球绝大部分包埋于胶原海绵内壁．这种进一步包被从形态上可能避免药物释放过程中的突释期，在一定程度上改善了药物的体外释放行为，使释放更加平稳并持续较长时间．

图2 不同放大倍数下载荷微球海绵的形态结构SEM图Fig.2 SEM images of morphology of collagen sponge integrated with bFGF-PLGA microspheres in different multiples

2.3 bFGF-PLGA微球载药量、包封率和体外释药性质

经检测和计算，bFGF-PLGA缓释微球的载药量和包封率均值分别为0.059 9%± 0.001 9%和79.9% ±2.8%(n＝5)，释药行为测定结果见图3．该载荷bFGF微球的胶原海绵的体外释药结果显示其体外释药过程较为稳定．胶原海绵载荷微球后，从第 5,d起开始平稳释放直至第 35,d(图中近乎直线形式)．而微球本身从第 8,d后才平稳释放．bFGF微球载荷在胶原海绵后，bFGF突释率(突释率为微球中药物在第 1,d的累积释放率，由图 3可得出相应数据)为 14.6%，小于微球本身的突释率 20.0%，证明微球与胶原海绵的复合能够有效地减小药物的突释现象，这与海绵进一步包裹药物微球有关．

近年来，组织工程研究愈来愈接近临床应用，而组织工程支架材料是其真正得到规模应用的根本．像细胞外基质(ECM)的结构与功能那样，只有在支架材料中载荷稳定而又控释的生长因子，才会对细胞和组织的生存提供理想的环境．本文所构建的载荷 bFGF-PLGA微球的胶原海绵有望发展成为一种具有对 bFGF进行中长期缓释功能的组织工程支架，为研制符合临床治疗需要的中长效注射制剂提供实验依据．同时，载荷 bFGF-PLGA微球的胶原海绵支架的研究又为深度创伤敷料的组织修复奠定基础．bFGF的持续释放特点将有效地促进组织再生和血管化过程[9]，期望载荷 bFGF微球的胶原海绵成为理想的组织工程支架材料或创伤修复材料．

图3 bFGF-PLGA微球及其载荷微球胶原海绵的体外释药曲线Fig.3 In vitro release curves of bFGF-loaded PLGA Fig.3 microspheres with and without collagen sponge

3 结 论

(1)bFGF-PLGA微球表面圆滑，载药量和包封率分别达到 0.059 9%± 0.001 9%和 79.9% ± 2.8%．

(2)bFGF-PLGA微球的胶原海绵缓释体系中，微球包埋在胶原海绵表面和内部结构当中，分散均匀．

(3)bFGF-PLGA微球的胶原海绵，体外释放药物比较稳定，较之微球本身，其药物有效缓释时间更长．通过 bFGF-PLGA 微球与胶原基质的复合，能够有效解决药物释放过程中的突释问题，突释率由20.0%降到14.6%．

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