酶解法提取肠膜肽工艺条件的优化

徐建超 章世元 全丽萍 谢月华 韩莉娜 侯文博

中国是生猪资源大国，产品肝素钠原料资源丰富，是世界上肝素钠主要出口国之一。目前我国主要以猪小肠粘膜为原料，提取的肝素钠（任红媛等，2007）抗凝活性高，在国际市场上颇受欢迎。肝素在组织内和其它粘多糖一起以共价键的形式与蛋白质结合成复合物，需进行水解使其解离下来（江燕等，2001），故该废水是一种高盐、高氮的高浓度有机废水，含丰富的肠膜蛋白，目前盐解法厂家可获得肠膜蛋白粉，酶解法中的肠膜蛋白则随污水排放。据侍爱秋（2002）的报道推算，我国肝素加工废水年排放量约64.2万吨，粗略估计含粗蛋白量高达4 333.5 t，数量可观。目前，许多企业以优质蛋白为原料，应用现代生物工程技术开发小肽系列产品，使其富含动物生长必需的有生命活动调节功能的生物活性肽和易吸收利用的营养性短肽。蛋白经过酶解或发酵处理后具有易于吸收、低抗原等特点，并能加快机体蛋白合成，提高机体免疫力，刺激消化道发育，增进动物食欲，促进矿物元素吸收，加速脂肪代谢等功能，从而提高生长速度，改善饲料利用率，是新一代绿色、高效、安全的营养性饲料添加剂。本试验利用各种蛋白酶水解肝素加工废水中的肠膜肽，确定最佳酶解条件，以期为该废水金属蛋白肽盐合成奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 原料

肝素加工废水是盐解法提取肝素钠工艺废水，捞取肠膜蛋白后其主要成分分析见表1。

表1 肝素加工废水主要成分分析

1.1.2 试剂

水解蛋白酶：活力2.4 AU-A/g；风味蛋白酶：活力1 000 LAPU/g；复合蛋白酶：活力1.5AU-NH/g。3种酶及酶活均来自诺维信（中国）生物技术有限公司。

1.1.3 仪器设备

pHB-5酸度计（上海伟业仪器厂生产）、4℃冷冻离心机（上海浦东天本离心机械有限公司生产）、SHT型精密数显磁力搅拌电热套（山东省菏泽市祥龙电子科技有限公司生产）。

1.2 试验方法

1.2.1 酶解工艺（陆利霞等，2008）

量取一定量肝素废水，用磷酸盐缓冲液调至不同pH值，准确加入不同量的各种酶（注：相对于底物粗蛋白含量，下同），在不同温度下，反应一定时间用酶解液灭酶（100℃，3 min），然后5 000 r/min离心 15 min，取上清液备用测定水解度。

1.2.2 总氮的测定

采用凯氏定氮法GB11891——89。

1.2.3 氨基氮的测定（郭艳，2008；陈贵堂等，2008）

采用甲醛滴定法GB/T5009.39——2003。

1.2.4 水解度的计算（张全才，2007；陈杰等，2007）

水解度(%)=(氨态氮/总氮)×100。

1.3 数据处理及统计分析

Excel建立数据库,SPSS17.0统计软件的ANOVA法进行方差分析,S-N-K法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 水解酶的确定

从肝素加工废水中提取易被动物吸收的肠膜肽，首先要确定水解酶。催化蛋白质水解的酶种类很多，主要有胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等。内肽酶将蛋白质分子内部切断形成多肽。外肽酶从蛋白质分子的游离氨基或羧基的末端逐个将肽键水解，而游离出氨基酸。工业生产上应用的蛋白酶主要是内肽酶，如木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶等。水解蛋白时，内肽酶和外肽酶复合作用才能得到高水解度的复合氨基酸液。外肽酶还能赋予产生的肽和氨基酸更多的香味和更饱满的风味。

本试验采用水解蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶及水解-风味复合酶。其中风味蛋白酶是外切酶，水解蛋白酶是内切酶，复合蛋白酶由内切酶和外切酶复合。根据各酶适用的水解条件为：pH值7，温度50 ℃，总酶量 2%，测定时间 1、2、3、4、5 h。采取 3 个平行试验，对时间因素选取5个水平，考察4种蛋白酶水解肝素废水测得的水解度，结果见表2。

表2 各种蛋白酶水解肝素废水测得水解度（%）

由表2可知,以肝素加工废水为底物，相比之下用风味-水解2：1复合酶水解效果最好。3 h时蛋白水解度最高,为7.49%。所以选择风味-水解复合酶做进一步研究。

2.2 风味-水解复合酶水解条件的初步确定

影响蛋白酶水解效果的因素有很多，如水解温度、pH值、水解时间、料液比、加酶量等。利用单因素试验法设计5组试验，分别考察风味-水解复合酶水解的最佳作用条件范围，对该酶水解条件进行初步确定。

2.2.1 最适反应时间的确定

采取3个平行试验，pH值为7.0，温度50℃，加酶量2.0%，风味蛋白酶、水解蛋白酶比例为2：1，时间分别调至 1、2、3、4、5、6、7、8、9 h，试验结果如图1 所示。

一般来说，同样的加酶量，水解时间越长水解度越高，到了一定的时间后上升趋势会减慢。由图1可见，反应时间对水解度影响较明显。在前5 h里随着反应时间的增加，蛋白水解度呈现先增加后降低的趋势，以3 h时水解度最大。5 h后随着反应时间的延长，水解度逐渐上升。可能是两种酶对该底物的最佳水解时间差距较大。考虑能耗因素，故确定最适反应时间为3 h进行后续试验。

2.2.2 最适总酶量的确定

采取3个平行试验，水解pH值为7.0、温度50℃、反应时间为3 h、风味蛋白酶、水解蛋白酶比例为2：1，改变反应体系中的酶添加量（1%、2%、3%、4%），考察酶添加量与肠膜蛋白提取率的关系，试验结果如图2所示。

由图2可知，当风味蛋白酶与水解蛋白酶以2：1比例复合时，总浓度在2%其水解度最大，所以确定两种酶总浓度最适为2%。

2.2.3 风味蛋白酶与水解蛋白酶最适比的确定

采取3个平行试验，水解pH值为7.0，温度50℃，反应时间为3 h，加酶总量为2%，风味、水解蛋白酶比例分别为 1： 1、2： 1、3： 1、4： 1，试验结果如图3所示。

由图3可知，酶总量为2%时水解度随风味蛋白酶与水解蛋白酶复合比例的升高呈现先增加后降低的趋势，两酶以2：1复合时肠膜蛋白水解度最大，但总体上两酶的比例对蛋白水解度影响不大。故确定风味蛋白酶与水解蛋白酶最适比为2：1。

2.2.4 最适酶解温度的确定

采取3个平行试验，水解pH值为7.0，反应时间为3 h，加酶总量为2%，风味、水解蛋白酶比例为2：1，酶解温度分别设为40、50、60、70℃，试验结果如图4所示。

酶对温度也比较敏感，有其最适的反应温度范围。由图4可知，随着温度的增加，水解度总体呈上升趋势，40℃至50℃上升较明显，50℃之后比较平缓，考虑经济因素，确定最适反应温度为50℃。

2.2.5 最适pH值的确定

采取3个平行试验，反应时间为3 h，加酶总量为2%，风味、水解蛋白酶比例为2：1，酶解温度为50 ℃，pH 值设为 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，试验中每隔半小时对pH值进行一次调节,试验结果如图5所示。

酶作为一种具有生物活性的蛋白质，环境pH值会影响酶分子的构象和酶分子及底物的解离状态，从而影响酶的活性和酶促反应速度。由图5可知，pH值对该酶水解效果影响较明显。随着pH值的增加，水解度呈下降的趋势，在pH值为4.0到7.0之间较平缓，而7.0之后下降幅度较大。所以选择pH值为4.0、5.0、6.0 进行正交试验。

2.3 风味-水解复合酶酶解正交试验

依据单因素试验初步确定的酶解条件，选择pH值，酶总浓度，风味、水解蛋白酶比例，反应时间，反应温度作为试验因素，以水解度为指标，采用L16（35）正交试验设计，对风味蛋白酶与水解蛋白酶酶解肝素废水条件进行优化，因素水平见表3，正交试验设计及结果见表4。

表3 L16（35）正交试验因素水平

表4 风味-水解蛋白酶水解肝素废水正交试验结果

表5 L16（35）正交试验结果方差分析

从极差分析正交试验的方差分析（表5）可以看出，五因素对水解度的影响程度不同，影响的主次顺序也不尽相同。其中酶总浓度和风味蛋白酶与水解蛋白酶量之比对水解度影响较大。各因素影响程度由大到小顺序为 C（风味、水解蛋白酶比例）＞B（酶总浓度）＞D（时间）＞A（pH 值）＞E（温度），最佳试验条件为 A2B3C1D1E1。根据 Ki分析的最佳组合为A1B3C3D3E1，用A1B3C3D3E1组合进一步试验，得肠膜肽水解度为16.18%。所以，风味蛋白酶与水解蛋白酶酶解肝素废水最佳组合为 A2B3C1D1E1，即酶总浓度3%，风味、水解蛋白酶比例为1：1，酶解温度50℃，pH值5.0，酶解时间2 h，此条件下的水解度为17.45%。

关于肠膜蛋白的提取，舒夏娃等（2007）选用木瓜蛋白酶对猪小肠黏膜提取肝素后的下脚料进行水解，结果表明，影响水解度的主次因素顺序为：温度＞底物浓度＞酶加量＞pH值，最佳的水解条件下的水解度为20.63%，此时底物浓度为6%。本试验得到的蛋白水解度偏低可能是由于底物浓度较低，而且由于原料性质的限制，未对底物浓度对酶解的效果进行考察。王春维等（2005）通过胰蛋白酶和木瓜蛋白酶对猪肠膜水解效果研究表明,木瓜蛋白酶优于胰蛋白酶,影响木瓜蛋白酶水解度的主次因素顺序为：时间＞温度＞pH值，最适条件下的蛋白水解度为83.45%。可见，蛋白水解度与底物的浓度，蛋白的含量有很大关系。

3 结论

确定风味-水解蛋白酶为最适水解酶。采用单因素及正交试验方法确定风味蛋白酶与水解蛋白酶复合酶酶解肝素废水的最适条件，即酶总浓度3%，风味、水解蛋白酶比例为1：1，酶解温度 50℃，pH值5.0，酶解时间2 h。在此条件下水解度为17.45%。

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