明目地黄丸中熊果酸含量测定方法比较

肖培云，杨永寿，许嘉强

（大理学院药学院，云南大理 671000）

明目地黄丸中熊果酸含量测定方法比较

肖培云，杨永寿，许嘉强

（大理学院药学院，云南大理 671000）

目的：研究改进明目地黄丸中熊果酸的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法和薄层扫描法进行含量测定比较。结果：高效液相色谱法，熊果酸分离完全，回归方程为Y=509 575X-14.851，r=0.999 7，在0.998～9.980μg范围内线性关系良好，平均回收率为92.6%，RSD为1.6%。薄层扫描法，回归方程为Y=77 594X-289.2，r=0.998 2，熊果酸在0.998～4.990μg之间呈良好线性关系，加样回收率为86.6%，RSD为5.6%。结论：高效液相色谱法比薄层扫描色谱法操作简便、快速、准确，可更好地控制明目地黄丸的质量。

明目地黄丸；高效液相色谱法；薄层扫描色谱法；熊果酸

明目地黄丸是传统的中成药方剂，是治疗眼病的常用中成药，收载于《中国药典》2010年版第一部中，由熟地黄、酒萸肉，牡丹皮、山药等12味药组成〔1〕，其功能为滋肾、养肝、明目，用于肝肾阴虚、目涩畏光、视物模糊、迎风流泪，并有治疗寒冷性过敏〔2-3〕，干眼症，视疲劳等作用〔4〕。另据文献报道，明目地黄丸配合中医针灸穴位注射治疗视网膜色素变性有较好疗效〔5〕。

酒萸肉为明目地黄丸配方中的主药，《中国药典》2005年版第一部“含量测定”项下采用薄层扫描法测定其主要化学成分熊果酸的含量〔2〕，2010年版中改用高效液相色谱法（HPLC）测定马钱苷的含量，以此来控制明目地黄丸中酒萸肉的质量〔6〕。而熊果酸为酒萸肉药材的特征性化学成分，对控制明目地黄丸的质量有重要意义〔7〕。本实验采用薄层扫描色谱法（TLCS）和HPLC对明目地黄丸中熊果酸的含量进行测定，通过这两种方法的比较，以找到一种操作简便、准确的方法，为明目地黄丸的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1200型高效液相色谱仪包括G1314B可变波长检测器，G1313A自动进样器，G1313A柱温箱，G1321A荧光检测器，Agilent 1200色谱工作站（美国安捷伦科技有限公司），Agilent XBP-C18（4.6mm×250 mm，5μm）色谱柱；CS-930薄层色谱扫描仪（日本岛津制作所）；UV2500紫外分光光度计（日本岛津制作所）；AE240电子天平（瑞士梅特勒）；超纯水器（成都唐氏康宁科技发展有限公司）；SK8200HP超声波清洗器（上海科导超声仪器公司）；RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 药品与试剂 明目地黄丸（云南龙发制药有限公司、腾冲东方红制药有限公司、腾冲制药厂）、熊果酸（中国生物制品药品检定所，批号：110742-200517），硅胶G板（青岛海洋化工厂），甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。

2 溶液的制备

2.1 对照品溶液的制备 取对照品熊果酸4.99 mg，加无水乙醇溶解定容到10mL作为对照品溶液，浓度为0.499 mg/mL〔8〕。

2.2 样品溶液的制备 取本品约10 g，精密称定，加水50mL使溶解，离心10min，倾去上层溶液，药渣加水80mL洗涤，离心20min，倾去上层溶液，于100℃干燥至松软粉末，连同滤纸一并放入索氏提取器中，加乙醚适量，加热回流4 h，提取液回收乙醚至干，残渣用20mL石油醚浸泡两次，每次2 min，倾去石油醚，残渣用三氯甲烷-无水乙醇（2∶3，V/V）混合溶液溶解，转移至5 mL量瓶中，定容，摇匀，作为样品溶液。

2.3 阴性对照液的制备 按处方制备不含酒萸肉的丸剂，再按供试品溶液的制备方法制成阴性溶液。

3 方法及结果

3.1 高效液相色谱条件的选择

3.1.1 测定波长的选择 取熊果酸对照品溶液适量，以无水乙醇为空白，在紫外分光光度计上进行扫描，见图1。结果表明，熊果酸在210 nm处有最大吸收。

图1 对照品紫外吸收光谱扫描图

3.1.2 色谱条件 色谱柱：Agilent XBP-C18（4.6×250mm，5μm），流动相：乙腈-甲醇-0.1%磷酸水（75∶15∶10，V/V），流速1mL/min，柱温：30 ℃，检测波长：210 nm。对照品和明目地黄丸样品的HPLC色谱图见图2和图3。

图2 对照品（1-熊果酸）

图3 样品（1-熊果酸）

3.2 薄层扫描法展开剂、扫描方式及波长的选择

3.2.1 展开剂 环己烷-氯仿-醋酸乙酯-冰醋酸（20∶5∶8∶0.5，V/V），展距8～10 cm，显色剂为10%硫酸乙醇溶液。

3.2.2 扫描方式 采用反射法锯齿扫描，狭缝0.4mm×0.4mm。

3.2.3 扫描波长的选择 吸取对照品溶液、样品溶液、阴性对照品溶液各5μL，分别点于同一薄层板上，展开。取出，晾干，显色，110℃烘至斑点显色清晰（约4～5min），在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定。薄层板置CS-930薄层扫描仪上在250～730 nm范围内扫描，结果显色后的熊果酸在540 nm处有最大吸收，样品图谱与对照品一致，而阴性对照品在540 nm处几乎无吸收，故选择540 nm为测定波长，700 nm为参比波长。

3.3 线性关系考察

3.3.1 HPLC 分别取0.499mg/mL的熊果酸对照品溶液2，5，8，10，15，18，20 μL进样，按上述色谱条件进行分析。以峰面积为纵坐标，以进样量为横坐标绘制标准曲线，回归方程为Y=50 957X-14.851，r=0.999 7，熊果酸在0.998~9.980μg范围内线性关系良好。

3.3.2 TLCS 分别吸取对照品溶液2，4，6，8，10 μL点于薄层板上。按“3.2.3”项色谱条件展开，晾干，显色，扫描，以熊果酸的量（μg）对峰面积求回归方程，得Y=77 594X-289.2，r=0.998 2，熊果酸在0.998~4.990μg范围内呈良好线性关系。结果表明HPLC比TLCS的线性范围广、线性关系更好。

3.4 重复性试验

3.4.1 HPLC 取同批样品（云南龙发制药100201），按照“2.2”项的方法处理样品5份，按“3.1.2”色谱条件进样10μL，结果见表1。

3.4.2 TLCS 取同批样品（云南龙发制药100201），按照“2.2”项的方法处理样品5份，按“3.2”的方法测定熊果酸含量，结果见表1。

3.5 稳定性试验

3.5.1 HPLC 取同一熊果酸对照品溶液，按“3.1.2”项条件每隔1 h测定一次，计算峰面积变化的RSD，结果见表2。

3.5.2 TLCS 吸取一定量对照品溶液点于薄层板上，按上述薄层色谱扫描条件展开，晾干，显色后每隔1 h扫描一次峰面积，计算峰面积变化的RSD，结果见表2。

表1 重复性试验

表2 稳定性试验

结果表明，在相同时间内，HPLC的稳定性更好，而TLCS在5 h内稳定。

3.6 回收率试验 精密称取已知含量的六味地黄丸适量，按表3加入0.499mg/mL的熊果酸标准品溶液适量，按“2.2”项方法处理。

3.6.1 HPLC 按“3.1.2”项色谱条件进样10μL测定，计算回收率，结果见表3。

表3 回收率试验

3.6.2 TLCS 按“3.2”项方法测定，计算回收率，结果见表3。由表3可看出HPLC较TLCS回收率高，RSD较小。

4 样品含量测定

取不同厂家，不同批号的样品按照“2.2”项的方法处理。HPLC：按“3.1.2”项色谱条件进样10μL，TLCS：按“3.2”项测定，结果见表4。

表4 样品含量测定

由结果可看出，HPLC的RSD较TLCS小，结果更为准确。

5 结果与讨论

通过对HPLC与TLCS测定明目地黄丸中熊果酸的含量比较研究，HPLC在精密度、稳定性、重现性、回收率等方面均较TLCS好。

由于熊果酸与齐墩果酸结构相近，采用TLCS难以将其分离，造成测定结果偏高，但采用HPLC，二者可完全达到基线分离，实验结果客观可靠，因此HPLC比TLCS更加适合用于明目地黄丸中熊果酸的含量测定。

〔1〕孙晓菊，胡军林.双波长薄层扫描法测定明目地黄丸中熊果酸的含量〔J〕.时珍国医国药，2001，12（12）：1078-1079.

〔2〕国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部〔M〕.北京：化学工业出版社，2005：492-493.

〔3〕查志坚.明目地黄丸治疗寒冷性过敏浅识〔J〕.实用中医内科杂志，2008，22（6）：99.

〔4〕宋立，王笑莲.明目地黄丸治疗干眼症临床观察〔J〕.中华中医药杂志，2008，23（8）：747-748.

〔5〕李种泰.明目地黄丸配针灸穴位注射治疗视网膜色素变性29例〔J〕.陕西中医，2005，26（11）：1178-1179.

〔6〕国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部〔M〕.北京：中国医药科技出版社，2010：815-816.

〔7〕杨剑芳，路福平，高文远，等.HPLC法测定山茱萸及其浸泡酒中熊果酸和齐墩果酸总量〔J〕.酿酒科技，2007（11）：100-103.

〔8〕赵君操，李宁.山茱萸皮、肉、果实部位的熊果酸含量比较〔J〕.中国医院药学杂志，2008，28（11）：950-951.

（责任编辑 蒋 康）

Comparison of Determ ination Method of Ursolic Acid in Mingmudihuang Pill

XIAO Peiyun，YANG Yongshou，XU Jiaqiang
（College of Pharmacy,DaliUniversity,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To improve a newmethod for the determination of ursolic acid in Mingmudihuang pill.Methods:The content of ursolic acid was determined by HPLC and TLCS.Results:The linear rangewas 0.998-9.980 μg（r=0.999 7）for ursolic acid at the HPLC and the linear relation was good.At the TLCS the linear range was 0.998-4.990μg（r=0.998 2）and the linear relation was good.Conclusion:The HPLC is simpler,more rapid and accurate,and can better control the quality of Mingmudihuang pill than the TLCS.

Mingmudihuang pill;HPLC;TLCS;ursolic acid

R944

B

1672-2345（2010）12-0004-03

2010-07-12

肖培云，副教授，主要从事中药材及其制剂质量控制研究.