运用益气方调节化疗所致红细胞减少症的作用机理研究

郭 焱，苏 颖，顾红缨，李春子，李 欣，朱 娜

（长春中医药大学，吉林 长春 130117）

肿瘤患者术后放化疗造成的毒副作用严重影响术后治疗与康复，特别是血中红细胞等明显减少对机体免疫机能产生严重影响，因此，采取有效措施防治放化疗的毒副反应，越来越引起广泛关注［1］。红细胞在防御系统（即免疫系统）中的重要地位，近年来逐渐被人们所认识。1981年美国学者西格尔（siegel）总结了许多学者的研究成果，提出红细胞也参与人体的防御工作，是人体免疫系统的一部分。近些年来研究表明，红细胞也是一类免疫细胞。红细胞免疫功能是藉助其膜表面分子 （如 CR1、CR3、CD58、CD59、DAF、SOD酶等）的免疫黏附作用，根据这样的原理我们可以检测红细胞和血红蛋白中红细胞的水平来间接表明机体的免疫功能情况。红细胞（RBC）Csb受体花环：RBC膜上Cb受体可与C3b致敏酵母多糖黏附形成花环；RBC免疫复合物（IC）花环：RBC膜黏附的IC中C3b分子可与酵母多糖黏附形成花环［2］。免疫酶标记技术是把抗原体的免疫反应和酶的高度催化作用有机结合而发展起来的一种免疫学分析技术。试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠粒细胞集落刺激因子（G-CSF）水平。本研究基于中医气血相生理论，根据临床治疗放化疗所致红细胞减少症的有效验方，探讨益气方调节化疗所致红细胞减少症的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 ICR小鼠，体重18 g～22 g，SPF级，雌雄各半，由本校基础实验中心提供。

1.1.2 药物与试剂 益气方是根据药典配方调配，常规煎药、过滤，饮片由本校附属医院提供。环磷酰胺（cyclophosphamide，CY）：每支 200 mg，江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号：04090321。EDTA-2Na：规格100 g，北京鼎国生物技术有限责任公司生产。氯化钠注射液：内蒙古康源药业有限公司生产，批号：09080405。磷酸氢二钠（无水）：规格 500 g，北京红星化工厂生产。磷酸氢二钾：规格500 g，天津市化学试剂第二厂生产。沙保氏琼脂：规格500 g，北京奥博星生物技术责任有限公司生产，批号：20070328。琼脂粉：规格500 g，天津市化学试剂六厂三分厂生产，批号：2003913。肝素钠抗凝剂：规格12 500 U/支，上海生物化学制药厂生产。小鼠红细胞刺激因子（ESF）试剂盒：美国BD公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与给药 取ICR小鼠50只，随机分为模型组、正常对照组、益气方高剂量组（高剂量组）、益气方中剂量组（中剂量组）、益气方低剂量组（低剂量组），每组10只，雌雄各半。动物室室温19℃～21℃，相对湿度40%～60%，每日光照12 h，实验期间动物可自由进食饮水，实验环境条件符合GB1495-94国家标准。给药组小鼠按剂量分别灌胃给药，各组给药剂量均按小鼠临床等效剂量计算所得［3］。正常对照组与模型组小鼠同时灌服等容量生理盐水，连续15 d，给药体积为30 mL/kg体重，每日给药1次。从第8天起模型组与各治疗组小鼠腹腔注射环磷酰胺80 mg/kg，连续3 d［4］，正常对照组小鼠同时注射等体积生理盐水。

1.2.2 小鼠红细胞C3b受体花环和免疫复合物花环实验［5］制备待测红细胞悬液：将肝素抗凝的指血或静脉血用生理盐水洗涤离心3次，2 000 r/min离心3 min～5 min，计数后配成1.25×107/mL红细胞悬液备用；补体致敏的酵母菌试剂：将酵母菌用生理盐水洗涤3次后，配成1%悬液，置水浴内煮沸20 min，充分混匀；用二层定性滤纸（或16层纱布）过滤，除去小凝块，在低倍镜下呈单个酵母菌细胞分散状态；加等量小鼠血清，混匀后置37℃水浴致敏15 min，用生理盐水洗涤1次，2 500 r/min离心10 min，去上清，用生理盐水重混悬，计数后配成1×108/mL补体致敏的酵母菌悬液。取两支小试管，每管加待测红细胞悬液100 μL，第一管再加补体致敏酵母菌悬液100 μL，第二管加未致敏的酵母菌悬液100 μL，摇匀放37℃水浴30 min；取出用手腕轻轻摇匀，加生理盐水 200 μL；混匀后，再加 0.25%戊二醛 75 μL 并轻轻混匀；分别取1/3量水平涂片、吹干，加甲醇固定；用瑞氏法染色，油镜下计数。

1.2.3 小鼠红细胞和血红蛋白水平的测定 于第15天末次给药20 h后小鼠眼球取血0.5 mL，加入2%EDTA-Na2固体抗凝剂100 μL抗凝，上全自动血液分析仪分析红细胞和血红蛋白水平。

1.2.4 小鼠红细胞集落刺激因子的测定 用ELISA法检测小鼠外周血ESF水平，小鼠眼球取血0.6 mL，3000 r/min，离心30 min分离血清，放置-20℃冰箱保存，进行小鼠红细胞集落刺激因子的酶联反应。

1.3 统计学方法

实验数据用SPSS软件进行方差分析两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 小鼠红细胞C3b受体花环和免疫复合物花环实验

与正常对照组比较，环磷酰胺模型鼠RBCC3bRR降低，RBC-ICR升高，证明造模成功。与模型组比较，服用益气方小鼠RBC-C3bRR升高，RBCICR降低，特别是益气方中剂量组RBC-C3bRR显著升高，RBC-ICR显著降低，表明益气方使CY化疗小鼠的红细胞免疫黏附功能上升，以中剂量疗效最佳。结果见图1。

2.2 小鼠红细胞和血红蛋白水平检测

CY具有细胞毒性，能抑制细胞分裂，致骨髓造血功能损坏，引发多系血细胞数量减少。实验表明，注射环磷酰胺后，小鼠的红细胞及WBC、HGB各项指标均显著低于正常小鼠，表明其处于免疫抑制状态。注射环磷酰胺并灌服益气方的小鼠外周血象较模型组小鼠明显提高，红细胞和血红蛋白有所增加，说明益气方对CY所致骨髓造血功能损伤有拮抗作用，并可恢复或改善机体免疫功能。益气方中剂量组上述各项指标显著增高，提示益气方可以抵消环磷酰胺引起的红细胞减少及细胞免疫损伤，使免疫损伤小鼠的红细胞数目增加，增强细胞的应答能力，对机体低下的细胞免疫具有一定的恢复作用。结果见图2。

2.3 小鼠红细胞集落刺激因子水平的测定

以ELISA法测定小鼠红细胞集落刺激因子，与模型组比较，各给药组小鼠红细胞集落刺激因子浓度升高，中剂量组显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）。说明益气方可拮抗化疗所致小鼠红细胞减少。结果见图3。

3 讨 论

近年来研究表明红细胞是不可忽视的免疫细胞，与白细胞一样具有重要的免疫功能。红细胞受神经内分泌系统调节，具有识别、黏附、杀伤抗原、清除免疫复合物（IC）［6］、参与机体细胞免疫和体液免疫调控的功能，而且参与细胞因子网络的调控。红细胞的免疫物质主要为存在于红细胞膜上的蛋白质分子，其中C3b受体数量占血液循环总数的95%以上，机体清除循环免疫复合物主要靠红细胞［7］。

研究结果显示服用益气方小鼠RBC-C3bRR比模型组显著升高，RBC-ICR显著降低，表明其红细胞免疫黏附功能上升，与文献报道一致［8］。作用机理为模型组红细胞携带免疫复合物增加，使红细胞C3b受体空位减少（表现在红细胞C3b受体花环率下降，CR1活性下降），免疫黏附的IC不易清除，而服用益气方的小鼠红细胞携带免疫复合物降低。细胞因子（CK）是由活化免疫细胞和非免疫细胞（如某些基质细胞）合成分泌的能调节细胞生理功能、参与免疫应答和介导炎症反应等多种生物学效应的小分子多肽或糖蛋白，是不同于免疫球蛋白和补体的又一类免疫分子，细胞因子存在的情况下，可以刺激红细胞生成。ELISA实验中的双抗夹心的原理，进一步说明益气方对化疗后小鼠红细胞减少症有作用［9］。益气方中的人参具有抗休克、抗疲劳、降血糖、促进造血系统的功能、减轻化疗药物对造血系统的损伤等作用，能增强机体免疫功能。人参属补气药，中医理论认为，气能统摄血液，补气可以生血生津。黄芪具有增强机体免疫功能、促进血清和肝脏蛋白质的更新、稳定红细胞膜、提高血浆组织内c-AMP的含量、增强免疫功能、促进再生肝DNA合成等多种作用。

益气方剂对环磷酰胺所致的小鼠红细胞减少症具有一定的治疗作用，提示益气方可作为肿瘤化疗、放疗患者的辅助治疗药物［10］。本实验结果显示，中剂量治疗组效果最为显著，高剂量治疗组次之，低剂量治疗组效果不明显，有关机制需进一步研究阐明。

［1］张大方.药理与中药药理实验［M］.2版.上海：上海科学技术出版社，2008：114.

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［3］陈敏.温肾补血汤治疗恶性肿瘤放疗后白细胞减少症32例观察［J］.实用中医药杂志，2002，18（5）：10.

［4］朱玲玲，朱莉莉.益气养阴法治疗放疗后白细胞减少症32例［J］.江苏中医药，2002，23（1）：22.

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