电针腧穴“胃病方”对急性胃黏膜损伤模型大鼠延髓和下丘脑c-fos表达的影响

闫丽萍，冀来喜，王海军 ，王 博，张夏毅，张天生 ，金晓飞

（1.山西中医学院针灸系，山西 太原 030024； 2.湖北中医药大学针灸系，湖北 武汉 430061；3.山西省针灸研究所实验中心，山西 太原 030006）

c-fos癌基因在细胞的静息状态下只有低水平的表达，因此细胞核内的c-fos样免疫反应阳性（cfos like immunoreactivity，c-FLI）表示神经元被激活。由于c-FLI表达具有敏感性、快速性、短暂性的特点，所以检测神经组织细胞核内的c-fos可以从单细胞水平上观察神经元的活动情况，从而得以追踪生理或药理刺激发挥作用的神经传导通路［1］。而且当机体受到某种刺激时，在该刺激信息向中枢传导的神经通路上，多数神经元均会出现fos蛋白阳性表达［2］。本实验从免疫组化的角度观察了电针腧穴“胃病方”对急性胃黏膜损伤大鼠延髓及下丘脑cfos蛋白表达的变化。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 清洁级Wistar大鼠40只（购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物编号：0071678），雌雄各半，体重（200±25）g。在中国辐射研究院实验动物中心（清洁级实验室）检疫并适应性喂养4 d，动物饲养室温度、采光、通风良好。用消毒的颗粒型大鼠饲料和自来水喂养，自由摄取。

1.1.2 药品与试剂 10%乌拉坦、无水乙醇、c-fos抗体及免疫组化试剂盒（武汉博士德公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与造模 40只wistar大鼠随机分为空白组、假模型组、模型组及胃病方组4组，每组10只。所有动物在实验当天的同一时间取出，捉拿动物时尽可能动作轻柔。在实验过程中，将动物置于柔软的实验台上，保持室温恒定和周围环境安静，避免不必要的刺激，以避免c-fos的假阳性表达。各组动物实验前24 h禁食，自由进水，实验2 h前禁水。空白组大鼠不做任何处理；假模型组大鼠2 h后灌入生理盐水1 mL，不作治疗，10%乌拉坦（10 mL/kg体重）腹腔注射麻醉大鼠后取材检测；模型组2 h后灌入无水乙醇1 mL，不作治疗，10%乌拉坦（10 mL/kg体重）腹腔注射麻醉大鼠后取材检测；胃病方组2 h后灌入无水乙醇1 mL，电针“胃病方”，10%乌拉坦（10 mL/kg体重）腹腔注射麻醉取材检测。

1.2.2 针刺方法 造模60 min后对胃病方组进行治疗，穴位取足三里、内关、中脘。穴位的定位：内关，前肢内侧，离鼠腕关节约3 mm左右的尺桡骨缝间；后（足）三里，膝关节后外侧，在腓骨小头下约5 mm处［3］；中脘，在大鼠的腹正中线上，以剑突为一定位点，以耻骨联合上缘为另一定位点，两者连线的上1/3段与下2/3段的交点［4］。1 mL无水乙醇灌胃1 h后即毫针垂直刺入大鼠以上穴位约5 mm，再在每个穴位旁开0.01寸（非穴位）刺入另外一根毫针，并以G6805-1型电针仪进行治疗，其中电针仪的一个负极连接穴位上的毫针，同一插口的正极接非穴位上的毫针。施以疏密波，频率10 Hz～30 Hz，电流强度以大鼠肢体微颤为宜。电针20 min，1 h后取材。

1.2.3 标本制作与免疫组化 电针治疗后，10%乌拉坦按1 mL/100 g体重麻醉大鼠，开胸暴露心脏，经心脏和升主动脉快速灌入生理盐水约200 mL至肝脏发白，然后经心脏灌注含4%多聚甲醛约200 mL至大鼠的身体发硬即可。再剥离下丘脑与延髓，置于4%多聚甲醛固定，石蜡包埋后，连续冠状切片，片厚 40 μm。

免疫组化SABC法按照试剂盒提供的方法操作。切片漂洗后裱片，晾干、脱水、透明、封固，光镜下观察并摄片。fos阳性细胞计数分别选择NTS和DMV （dm-nx）。每只大鼠随机选择一套延髓片，在10（目镜）×10（物镜）倍率下，计算该套切片中延髓和下丘脑中fos阳性细胞的总和，而后在每组动物间取均数。

1.3 统计学方法

2 结 果

对照实验（PBS代替一抗）为阴性。空白组大鼠延髓和下丘脑部c-fos阳性细胞有少量表达，而胃黏膜损伤后延髓和下丘脑中c-fos阳性细胞个数增多，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，经电针胃病方治疗后延髓和下丘脑中cfos阳性细胞个数明显增多（P<0.05）。结果见表1，图1、图 2。

表1 各组大鼠c-fos蛋白在延髓和下丘脑表达的比较 （±s）

表1 各组大鼠c-fos蛋白在延髓和下丘脑表达的比较 （±s）

注：与空白组比较，1）P<0.05；与模型组比较，2）P<0.05

下丘脑部fos阳性细胞数（个）空白组 10 5.86±1.56 5.71±2.26假模型组 10 6.03±1.68 7.89±3.04模型组 10 32.72±3.831） 25.36±6.681）胃病方组 10 46.59±4.121）2） 37.58±3.711）2）组别 n 延髓部fos阳性细胞数（个）

图1 各组大鼠大鼠c-fos蛋白在延髓表达图

图2 各组大鼠大鼠c-fos蛋白在下丘脑表达图

3 讨 论

c-fos蛋白是c-fos癌基因（它是反转录病毒vfos癌基因的同源序列，是即早基因 ［（Immediateearly gene）家族中的一员］的表达产物，同时它是一种核内的磷蛋白，在胞浆内翻译后经修饰迅速进入核内，与DIAL结合发挥其对靶基因（target gene）的调控作用。c-fos表达可能是神经元被刺激激活的一种标志，可用以分析中枢神经系统的神经元受到外周刺激后的活动变化［5］。

存在于正常细胞内的c-fos原癌基因所编码的fos蛋白在神经系统的信号传导中起重要作用，它被认为是一种第三信使调控靶基因的表达［6］。c-fos作为第三信使在功能性胃肠疾病的发病机制研究中提供了可靠而快捷的方法［7-8］。当机体受到刺激时，兴奋性信息通过神经通路传递至中枢神经系统，许多神经元中c-fos蛋白呈阳性表达，这一结果不仅已在形态学上得到证实，而且还具有一定程度的功能意义［9-10］。

针灸的效应与其对中枢神经系统的影响有着密切的关系，而通过c-fos表达，我们可以比较清楚地了解针灸对中枢神经系统的影响。王成夭等［11］运用RNA斑点杂交方法比较了电针足三里穴与福尔马林注射于足掌皮下对大鼠c-fos mRNA表达的影响。结果表明电针和福尔马林刺激后均可诱发cfos mRNA表达增强，吗啡能明显抑制福尔马林诱导c-fos mRNA表达，而对电针诱导的c-fos mRNA表达无明显影响，提示两种刺激的传入途径不同，电针不等同于伤害性刺激。展淑琴等［12］研究发现电针针刺大鼠足三里可引起其脑内下丘脑室旁核、下丘脑室周核和视上核c-fos的表达，表明电针引起了这些部位神经元活性的变化，在实验中也有类似的发现。

尽管人们通过c-fos技术对单穴在中枢的神经通路做了大量的研究，但多穴的中枢通路尚未见报道。基于上述原因，本实验从免疫组化的角度观察了电针腧穴“胃病方”对急性胃黏膜损伤大鼠延髓及下丘脑c-fos蛋白表达的变化。结果发现，胃黏膜损伤后延髓和下丘脑中c-fos阳性细胞个数增多，与模型组相比，经电针胃病方治疗后延髓和下丘脑中c-fos阳性细胞个数明显增多。同时参照大鼠脑图谱，c-fos阳性细胞在延髓的孤束核、三叉神经背核及背侧网状亚核等核团和下丘脑背外侧区表达较多。孤束核、三叉神经背核是内脏感觉神经纤维的传入部位，背侧网状亚核与痛觉传导相关，它们与下丘脑都有直接或间接的神经纤维投射。但以上部位是否为三个穴位共同作用部位不是很明确，仍需进一步证实。

［1］Hrrera D G，Robertson H.Activition of c-fos in brain［J］.Progress in Neurolgy，1996，50（2）：83-107.

［2］杨志军，饶志仁，邱建勇，等.膈下迷走神经切断术抑制腹腔给予LPS 诱导的延髓内脏带内 fos表达 ［J］. 解剖学报，2000，31（2）：97.

［3］李忠仁.实验针灸学［M］.北京：中国中医药出版社，2003：327-329.

［4］王海军，冀来喜.关于大鼠神阙穴的定位［J］.针刺研究，2007，10（5）：50.

［5］Dragunow M，Faull R. The use of c-fos as a metablic marker in nueuronal pathway tracing ［J］.J Neurosci Methods，1989，29（1）：261.

［6］Gilby K L，Armstrong J N，Curre R W，et al.The effects of hypociaischemia on expression of c-fos，c-jun in the young rat hippocampus ［J］.Molecular Brain Research，1997，48（3）：87.

［8］章菲菲，莫剑忠.c-fos在胃肠道刺激信号传入研究中的应用［J］.国外医学·消化系疾病分册，2004，24（1）：35-37.

［9］章诺贝.原癌基因在组织损伤修复中的作用［J］.国际病理科学与临床杂志，2006，26（3）：190-192，195.

［10］王曦，王百忍，段晓莉.正常生活状态下的大鼠脑中fos的基础表达［J］.神经解剖学杂志，2000，16（4）：53-35.

［11］王成夭，刘颖涛，万德宁.电针和福尔马林诱发脑c-fos基因表达研究［J］.湖北医科大学学报，1999，20（2）：135-137.

［12］展淑琴，赵晏，郭新奎，等.电针针刺足三里对大鼠脑内c-fos表达的影响［J］.山东中医药大学学报，2005，29（1）：57-58.