元蘑单孢杂交育种试验研究1)

张跃新,闫宝松,马凤,毛宪伟

(1.黑龙江省林副特产研究所,黑龙江省非木质林产品研发重点实验室,牡丹江 157011;2.牡丹江市林业局三道关林场)

元蘑学名亚侧耳(Hohenbuehelia serotina),是黑龙江省特有的山珍之一。元蘑肉质细腻,柔嫩鲜美,营养价值极高,经常食用具有加强肌体免疫,增强机体抵抗能力,益智开心,益气不饥,延年轻身等作用。近年来,我省元蘑栽培已初具规模,元蘑已成为我省食用菌的特色产品,产品除我省内销外,在全国各地均有不同的市场需求。但不容忽视的是,我省元蘑产业还存在着菌种市场混乱、养菌后熟时间过长、平均产量不高等问题,为了解决这些问题,除了改善生产技术手段以外,更重要的一点就是改良品种,选育出产量高、后熟时间短的元蘑优良品种。本文通过单孢杂交育种试验,选育出了元蘑优良品种,为元蘑产业的发展奠定了基础。

1 元蘑菌株性状调查与优良菌株收集

1.1 元蘑生产菌株调查与采集

我省元蘑主产区为牡丹江地区、伊春地区、尚志市,牡丹江地区尤以东京城林业局、大海林林业局元蘑产业较为突出。课题组在牡丹江地区东京城林业局、大海林林业局收集元蘑优良生产菌株各1个,编号为“元1” 、“元 2” 。

表1 元蘑主产区产量性状调查表

1.2 野生元蘑品种的采集

课题组深入三道关林区进行了野生元蘑的采集,共采集野生元蘑品种2个,分别编号为“元3”、“元4”。其性状见表2。

表2 野生元蘑性状调查表

2 单孢杂交试验

2.1 供试菌株

元 1,元 2,元 3,元 4(见表 1 、表 2)。

2.2 供试培养基

孢子萌发培养基:马铃薯 20g、葡萄糖 20g、琼脂20g、硫酸镁 1.5g、磷酸二氢钾 3g、蛋白胨 5g,水1000mL;

PDA综合培养基:马铃薯20g、葡萄糖20g、琼脂20g、硫酸镁1.5g、磷酸二氢钾3g,水1000mL。

2.3 水分对孢子萌发的影响试验

将孢子分为两组,分别用无菌水稀释,并用血球计数板计算孢子数量。第一组稀释后直接涂布在培养皿上,每个培养皿涂布100个孢子,三次重复,暗光25℃培养;第二组在 25℃条件下分别浸泡 0、8、16、24、32、40、48 、56、64 、72、80 h,浸泡后分别涂布于培养皿上,每个培养皿涂布100个孢子,三次重复,暗光25℃条件下培养,计算孢子萌发数。

2.4 单核体菌株的获得

将孢子用连续稀释法稀释,涂布于培养皿上,经暗光25℃条件下培养,经镜检观察,无锁状联合即为单孢菌丝。

2.5 单核体配对杂交

将两个不同亲本的单核菌丝同时接种于平板培养基上,相距1.0～1.5cm,培养12d左右,待两菌丝接触后,挑取交界处的部分菌丝进行镜检,如发现锁状联合,立即将其转接于新的斜面培养基上。

2.6 营养亲和性试验

在斜面培养基的中间接种单孢杂交菌丝体,两端分别接种亲本的菌丝体,菌丝能互相长进去,连成一片的说明是同种菌丝,若在相交处形成明显的黄褐色拮抗线,便说明菌种性质不同。只有在斜面上同时出现两条拮抗线,才说明杂交成功,产生了新的性状。

2.7 初筛试验

将元1、元2、元3、元13、元23进行3级种的制作,各做50袋菌种,进行初步筛选。

2.8 复筛试验

将初筛出的元13、元23杂交菌株进行袋栽复筛,连同CK(元1、元 2、元3)各栽300袋。对比平均产量及菌种成熟时间,最终筛选出元蘑优良新品种。

3 结果与分析

3.1 水分对孢子萌发的影响试验

图1 水分对孢子萌发的影响

由图1可知,孢子不经浸水处理在40h以后才有少量萌发,在72h后才大量萌发;孢子经浸水处理后,在16h后就有少量萌发,在40h后大量萌发,但超过40h后,孢子的萌发数反而下降。因此,元蘑孢子经无菌水浸泡40h后萌发率最高。

3.2 单核体菌株的获得

挑取单孢萌发菌丝进行培养,经单核体菌株菌丝体长势观察,筛选出菌丝体生长速度快,长势旺盛的单核体菌株作为配对杂交所用的亲本菌株。最终筛选出16个单核体用于杂交配对。

3.3 单核体配对杂交

杂交组合分别为元1×元2共24个组合,元1×元3共24个组合、元1×元4共24个组合、元2×元3共24个组合、元2×元24共4个组合、元3×元4共24个组合,合计杂交组合144个。

3.4 拮抗线检测

在杂交的144个组合中共有91个组合产生拮抗线,元1与元2亲缘关系较远,元1与元3亲缘关系较近,元1与元4亲缘关系较远,元2与元3亲缘关系较近,元2与元4亲缘关系较远,元3与元4亲缘关系较远。

3.5 镜检锁状联合标记

对未形成拮抗线的53个组合镜检有无锁状联合,即说明通过杂交形成了具有锁状联合的双核菌丝体,表明杂交亲和,共有2个组合,认为是杂交菌株。

3.6 营养亲和性鉴定

这2个杂交菌株中与双亲均存在明显拮抗现象,接触处形成埂状的拮抗线。说明这2个菌株与双亲均形成拮抗线的杂交菌株的遗传物质发生了一定的变异,在生长代谢方面可能产生了某些与亲本菌株相互有抑制作用的物质。拮抗现象表明这些杂交菌株是与双亲不同的菌株。

经初步杂交试验,获得杂交品种2个,即元1×元3组合、元2×元3组合的杂交种各1个,分别编号为元 13、元 23。(见表3)

表3 元蘑杂交结果

3.7 初筛试验

经初筛试验,筛选出养菌期后熟时间短、菌丝长势好、菇型较好、产量较高的的杂交菌株元13、元23各2株。

3.8 复筛试验

3.8.1 杂交菌株复筛产量分析

表4 杂交菌株复筛产量分析

杂交菌株复筛产量分析表明,元23、元13产量显著高于其亲本菌株(CK),元23与元13在产量上无显著差异。

3.8.2 元蘑复筛菌丝体成熟时间显著性分析

表5 元蘑复筛菌丝体成熟时间显著性分析

由表5可知,元13在菌丝体成熟时间上与其亲本有显著差异,元23菌丝体成熟时间较短,但与其亲本无显著差异。因此,元13在菌丝体成熟时间上明显优于其它菌株。

4 结论与讨论

4.1 复筛试验表明,在产量方面,杂交品种元 13、元23的产量均比其亲本产量显著提高,产量性状较好;在菌丝体成熟时间上,元13菌丝体成熟时间短,显著优于其它菌株,但元23与其亲本无显著差异。综合比较,元13的性状优于元23,因此,选定元13为元蘑杂交优良品种。

4.2 食用菌杂交育种是食用菌品种选育中应用最广泛、收效最显著的育种手段,尤其是单孢杂交育种,能获得菌种更纯的杂交品种。但严格意义上来讲,单孢杂交育种并没有经过核融合后分子水平上的基因重组,只是一种细胞水平上的物质重组。理论上,杂交后F2代菌株再经过单孢杂交就有可能得到核融合菌株,其优良性状可能更多。因此,建议以后做F2代单孢杂交育种试验。

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