走马芹提取物对杨树烂皮病的抑制作用研究

孙妍,张国财,刘瑞鹏,赵杨,张欣倩,孙实,马力

(1.东北林业大学,哈尔滨 150040;2.黑龙江省平山林业制药厂)

走马芹[1](Angelica dahurica):伞形科,当归属。多年生大型草本植物,株高100cm左右。根灰褐色,具辛辣香气,辣气较香气重。主要生长在山地河谷、草甸,山坡林缘、林间草地。中国主要分布在东北和华北地区。主要化学成分:含佛手柑内酯(bergapten)、二氢山芹当归油酯(columbianadin)、二氢山芹醇(columbianetin)、二氢山芹醇乙酸酯、伞花内酯(umbelliferone)、当归醇A-H(angelol A-H)及东茛菪内酯等多种香豆精类化合物。

杨树烂皮病[2]〔Cytospora chrysosperma(Pers.)Fr.〕:我国杨树栽培区都有发生,但主要分布在东北、西北、华北等地。危害各种杨树(Populus spp.),以及旱柳(Salix matsudana)、榆(Ulmus pumila)、板栗(Castanes millissima)、槭(Acer spp.)、桑(Morus alba)、接骨木(Sambucus spp.)、木槿(Hibiscus syriacus)、花楸(Catalpa ovata)等。是公园、绿地、行道树和苗圃杨树的常见病和多发病,常引起行道树大量枯死,新移栽的杨树发病尤重。近几年,杨树烂皮病的发生量及发生程度呈上升的趋势[3]。

本研究从生物活性的角度对走马芹的抑菌性进行了初步研究,发现其具有较强的抑菌作用。

1 材料和方法

1.1 供试植物和菌种

供试走马芹采自黑龙江省伊春市凉水国家级自然保护区。

供试杨树烂皮病菌种由发病杨树上分离鉴定得到。

1.2 仪器和试剂

1.2.1 仪器。DHG-9240电热恒温鼓风干燥箱、FDV高速风选式超细粉碎机、DK-S26型电热恒温水浴锅、AS20500A型超声波清洗器、RE-52A旋转蒸发仪、SHB-IIIA循环水式多用真空泵、HPG-400光照培养箱。

1.2.2 试剂。分析乙醇、聚山梨酯-80、琼脂、葡萄糖、马铃薯、

1.3 植物提取物母液的制备[4-5]

将走马芹放入干燥箱中干燥、粉碎。取 10g装入300mL三角瓶中,加入80%乙醇250 mL,置于50℃恒温水浴锅内温浸3h,然后放到超声波提取器中振荡40min,取出再置于50℃恒温水浴锅内温浸3h,然后将浸好的药液用真空泵减压抽滤,得到澄清的乙醇粗提液。将乙醇粗提液在40℃下用旋转蒸发仪进行减压浓缩,减压浓缩至原液呈现出浓油状为止,用10%的聚山梨酯-80作为溶媒进行溶解定容至50mL(即质量浓度为200mg/mL),物理灭菌后备用。

1.4 抑菌活性测定方法

1.4.1 PDA培养基的制备。将洗净去皮的马铃薯200g切碎,加水1000mL煮沸30 min,用纱布滤去马铃薯,加水补足1000mL,然后加18g琼脂和20g蔗糖,加热使琼脂完全溶化,趁热用纱布过滤,而后分装三角瓶中,加棉花塞后在121℃下加压蒸汽灭菌20min后备用。

1.4.2 带毒平板培养基的制备。精确取不同量的母液分别与热的PDA培养基均匀混合于培养皿内,使其体积达到10mL,冷凝后即成为不同浓度的带毒培养基。

1.4.3 生长速率法测定抑菌率[6]。在超净工作台内,用直径为5mm的打孔器在培养好的菌落外缘切下带菌培养基菌饼。用灭过菌的接种针小心将菌饼放置在带毒培养基和对照培养基上,菌丝面向下,每皿接一块,置于26℃恒温培养箱内培养。每隔24h观察1次,用十字交叉法测量菌落直径两次,取平均值。根据公式(1)和(2)计算菌丝生长抑制率:

2 结果与分析

以观察时间为横坐标,对杨树烂皮病菌的抑制率为纵坐标作图(见图1)。由图1可知,不同浓度的走马芹提取物均在48h后对杨树烂皮病原菌产生较强的抑制作用,并持缓慢增长趋势。

以浓度为横坐标,对杨树烂皮病菌的抑制率为纵坐标作图(见图2)。由图2可知,不同浓度的走马芹提取物对杨树烂皮病菌的抑制作用呈对数增长趋势。曲线方程为:

Y=2.8625Ln(X)+76.055复合系数 R2为 99.27%,由此可计算出 EC50为 0.11μ g/mL。

图1 不同浓度提取物

图2 走马芹提取物对杨树烂皮病菌抑制曲线图

3 结论

将超声技术应用于走马芹活性物质的提取,不仅保持有效成分的活性,同时节省时间,简化提取纯化流程,提高提取效率。本文探讨了走马芹的80%乙醇超声波提取物对杨树烂皮病原菌的抑制作用,结果表明,走马芹的提取物对杨树烂皮病原菌有较强的抑制作用,提取物的浓度与抑制作用呈正相关关系,其抑制率呈对数增长趋势。

[1] 聂绍荃,袁晓颖.黑龙江省植物资源志[M].东北林业大学出版社,2003.

[2] 周仲铭.林木病理学[M].中国林业出版社,2005:164-167.

[3] 信桂芳,王惠玲.杨树腐烂病发生现状调查分析及应对措施[J].河北林业科技,2007(2):24.

[4] 张全军,王泽南.超声波波提取荸荠皮抑菌物质的工艺研究[J].食品与机械,2007,23(6):59-61.

[5] 纪淑娟.丁香抑菌成分超声波提取工艺研究[J].食品科学,2008,29(05):201-204.

[6] 方中达.植病研究方法[M].3版.北京:中国农业出版社,1998:151-154