水飞蓟素固体分散体对CCl4致小鼠急性肝损伤的保护作用

杨 逊， 陈 钧*， 韩邦兴，2， 赵 磊， 李晨光， 杨 雪

(1.江苏大学药学院，江苏 镇江212013;2.植物细胞工程安徽省工程技术研究中心，安徽 六安237012;3.江苏工业学院信息科学与工程学院，江苏常州213164)

水飞蓟素(silymarin)系指从菊科植物水飞蓟(Silybum marianum L.Gaertn)的种子中提取的一类黄酮木脂素类成分，主要存在于种皮中［1］，具有抗自由基、保护肝细胞膜、抗脂质过氧化、抗肿瘤、降血脂等药理作用［2］，对大脑的氧化应激［3］及烫伤引起的氧化性皮肤损伤［4］具有保护作用。水飞蓟素难溶于水，因此提高其生物利用度具有重要的临床意义［5］。为了提高生物利用度，目前水飞蓟素的制剂有固体分散体、脂质体、磷脂复合物、羟丙基-β-环糊精包合物、滴丸等［6］。

固体分散技术是一种能够提高难溶性物质溶出速率的制剂技术，其制备方法简单，但未见水飞蓟素固体分散体的药效学研究。本试验旨在将从水飞蓟种皮中提取的水飞蓟素制备成固体分散体，通过指标的测定，考察其对CCl4致小鼠急性肝损伤的保护作用，并与市售的普通片剂进行比较。通过Hism函数，考察各组与空白组间的相似系数，从整体上考察各组间的差异。

1 仪器、试剂与动物

HH66MC超声机，无锡超电子设备厂;DHG-9076A型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏试验设备有限公司;UV-2550紫外分光光度计，日本岛津公司;Z-1智能溶出度仪，天津大学仪器厂;THZ-C恒温振荡仪，江苏太仓市试验设备厂;spectral90型酶标仪，美国MD分子仪器公司。

乙酸乙酯、无水乙醇、PVP-K30(聚乙烯吡咯烷酮)，盐酸(浓度为36.5%)、羟甲基纤维素钠(CMCNa)，CCl4，购自国药集团化学试剂有限公司;水飞蓟宾对照品(批号0856－200203)，购自中国药品生物制品检定所;ALT、AST、SOD、MDA测定试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所;益肝灵(批号:080302，每片重0.18 g，含水飞蓟宾38.5 mg)，江苏中兴药业有限公司。

pH值为1.2的人工胃液:取稀盐酸16.4 mL，加水约800 mL与胃蛋白酶10 g，摇匀后，加水稀释至1 000 mL即得;水飞蓟种皮:由江苏中兴药业有限公司提供。

ICR小鼠，♀♂各半，体重为18～22 g，购于扬州大学比较医学中心，许可证号为SCXR(苏)-2007-0001。试验前于实验室内适应性饲养一周。

2 方法

2.1 标准曲线

用紫外分光光度法，测定水飞蓟素的含量。紫外光谱扫描显示，PVP的加入不影响水飞蓟素的最大吸收波长(287 nm)。精密称取105℃干燥至恒重的水飞蓟宾对照品6.4 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。精密移取0.25、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 于 10 mL 量瓶中，分别加水、人工胃液定容至刻度。以A表示吸光度，C表示浓度mg/mL，以水为背景的回归方程为A=43.821C+0.018 5，R2=0.998 6;以人工胃液为背景的回归方程为 A=48.651C+0.026 4，R2=0.998 6。

2.2 水飞蓟素固体分散体的制备

采用热回流提取法，以6倍量乙酸乙酯于80℃水浴锅中连续提取水飞蓟种皮8 h，回收溶剂、烘干、石油醚洗涤，得提取物，UV法测得提取物中水飞蓟素的含量为82.15%，HPLC法测得水飞蓟宾的含量为36.97%。根据溶剂法［7］制备固体分散体，按照1∶1、1∶3、1 ∶5、1 ∶7、1 ∶9、1∶11 准确称取水飞蓟素与PVP，用适量的无水乙醇，超声溶解，在60℃水浴上挥去溶剂，于60℃电热恒温鼓风干燥箱内烘干，取出后粉碎过60目筛，保存备用。

2.3 溶解度试验

称取0.5 g水飞蓟素及不同比例的水飞蓟素-PVP固体分散体，各加入5 mL蒸馏水中，使其呈过饱和状态，置37℃恒温空气振荡器中，120 r/min振摇24 h，以4 000 r/min速度离心15 min，取上清液，用0.45μm的微孔滤膜过滤后，于287 nm处测定其紫外吸光度，求其溶解度。

2.4 体外溶出度试验

试验方法按照《中华人民共和国药典》(05版)［8］二部“附录 XC”规定，采用第二法(桨法)测定自制水飞蓟素及其固体分散体的体外溶出度。以900 mL脱气后的人工胃液为溶出介质，转速(100±1)r/min，水浴温度为37℃。分别取水飞蓟素及其固体分散体(含水飞蓟素80 mg)粉末均匀撒入介质中，分别于5、10、20、30、45、60、120 min 取样，每次 5 mL，并补充等体积的释放介质，取样液用0.45μm的微孔滤膜过滤后，于287 nm处测定其紫外吸光度，求其体外累积溶出率%。

2.5 CCl4致小鼠急性肝损伤模型的建立及动物试验

ICR小鼠60只，体重为(20±2)g，每组10只，♀♂各半，随机分为空白组(正常饲养，不做任何处理)、模型组(造模不给药)、益肝灵低剂量及高剂量组(益低组、益高组)、水飞蓟素固体分散体低剂量及高剂量组(固低组、固高组)，共6组。

益肝灵说明书可知，成人用量为每日231 mg水飞蓟宾，根据《药理实验方法学》中剂量的换算［9］，并按照不同给药剂量的动物试验中片剂与固体分散体水飞蓟宾的给药量各自相等的原则，确定试验小鼠水飞蓟宾的灌胃量:低剂量组为30 mg/kg，高剂量组为120 mg/kg。用0.5%的CMC-Na分别溶解益肝灵及固体分散体，配制好相应的浓度后，各组按10 mL/kg灌胃给药，空白组和模型组灌服相应剂量的0.5%CMC-Na，每日1次，连续6 d，第6天灌胃后2 h后，除空白组，每组小鼠按10 mL/kg注射含0.1%CCl4的大豆色拉油溶液，同时禁食不禁水。

2.6 指标的测定

造模20 h后，小鼠眼眶取血，分离血清，测定ALT及AST活力。小鼠处死后，取小鼠肝称重并计算肝系数(肝脏湿重与体重之比)。同时，制备10%的肝匀浆，测定肝匀浆MDA及SOD。以上指标均按试剂盒操作说明测定。

2.7 统计分析

3 结果

3.1 水飞蓟素固体分散体的溶解及溶出特性研究

3.1.1 溶解度试验结果

水飞蓟素在水中的溶解度为0.145 mg/mL。由图1可知，随着水飞蓟素固体分散体中PVP的增加，水飞蓟素在水中的溶解度逐渐增加。当比例为1∶5、1∶7、1∶9、1 ∶11 时，固体分散体的溶解度分别是水飞蓟素溶解度的36、62、64和90倍，由此可见，辅料PVP显著增加水飞蓟素在水中的溶解度。

图1 水飞蓟素-PVP固体分散体在水中的溶解度

3.1.2 体外溶出度试验结果

由图2可知，当无PVP加入时，水飞蓟素在介质的溶出速率和溶出度都较低，120 min过后只有20%左右。载体PVP的加入，使溶出的速率和程度都有不同程度的提高，但1∶7与1∶9的固体分散体体外溶出度相差不大。而当水飞蓟素与PVP比例为1∶7时，溶解度同样得到显著提高，为了控制PVP的用量，选择此比例进行小鼠试验。

图2 水飞蓟素-PVP固体分散体的累积溶出曲线

3.2 固体分散体对小鼠急性肝损伤的保护作用

3.2.1 指标的测定结果

各组小鼠分别进行五个指标的测定，见表1。结果可知，模型组与空白组均有极显著差异(P<0.01)，说明造模成功。

肝系数测定结果中，各用药组与模型组均有显著性差异(P<0.05)，说明水飞蓟素能够有效的改善CCl4引起的小鼠肝脏肿大;益低组、益高组、固低组的ALT与模型组无明显差异，其改善指标ALT作用不强，但固高组与模型组存在极显著性差异(P<0.01)，且固高组与益高组之间存在极显著性差异(P<0.01)，可知固体分散体效果强于片剂益肝灵;除益低组，其它各治疗组的AST与模型组均存在显著差异(P<0.05，P<0.01)，且固体分散体与相应剂量的益肝灵相比差异显著(P<0.05)。

SOD与MDA测定结果显示，治疗组不同程度使降低的SOD值升高、使升高的MDA值降低，且固体分散体对MDA的影响程度明显高于益肝灵(P<0.05，P<0.01)。

3.2.2 各组与空白组间的综合分析

表1 固体分散体对小鼠肝系数、ALT、AST、SOD、MDA的影响(±s)

表1 固体分散体对小鼠肝系数、ALT、AST、SOD、MDA的影响(±s)

注:与空白组相比，☆☆P<0.01;与模型组相比，△P<0.05，△△P<0.01;与相应剂量的阳性对照药益肝灵相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

组别 水飞蓟宾剂量/(mg/kg)肝系数/%ALT/(U/L)AST/(U/L)SOD/(U/mgprot)MDA/(nmol/mgprot)空白组 — 4.85±0.06 27.10±2.26 58.57±4.84 149.41±3.01 3.47±0.45模型组 — 6.18±0.09☆☆ 124.65±3.85☆☆ 174.22±6.61☆☆ 82.73±3.46☆☆ 6.09±0.21☆☆益低组 30 5.37±0.08△ 111.93±9.30 154.4±12.64 97.57±4.45△△ 4.51±0.43△△益高组 120 5.20±0.11△ 102.37±4.97 149.06±6.98△ 103.19±1.32△△ 3.64±0.26△△固低组 30 5.22±0.05△ 103.25±15.1 128.10±7.25△△▲ 113.53±6.11△△ 3.80±0.39△△▲固高组 120 4.98±0.12△ 50.89±14.03△△▲▲ 70.46±10.50△△▲ 143.59±7.14△△ 3.08±0.18△△▲▲

由以上5个指标的测定可知，治疗组对各指标均有改善作用，但各个治疗组对不同指标的影响程度不相同，为了充分比较固体分散体与片剂益肝灵之间的差异，进一步从整体上进行分析。

设 X=(x1，…，xd)和 Y=(y1，…，yd)是 d 维空间中的两个点，相似性度量函数如下［10］:

取表1中各个指标的平均值构成6×5的矩阵，将每两组5个指标的数值分别代入Hism函数进行计算，求出组间相似系数。试验中，d(d=5)为指标个数，xi、yi为所比较的两组(X与Y)中第i个指标的平均值。Hism函数描述多维空间中两点的接近程度，当两点完全重合时，函数值为1;当两点无限远离时，函数值为0。当以空白组为比较基准时，该函数值越大，表示被比较组的数据总体上越接近空白组，即治疗效果越好。

由表2可知，各试验组与空白组之间的相似系数由大到小依次是:固高组，益高组，固低组，益低组，模型组，其中固高组与空白组最接近，说明固体分散体的效果明显优于片剂，且一定范围内的高剂量优于低剂量。

表中固高组和益高组与空白组之间的相似系数之差为0.043 2，而固低组与益低组与空白组之间的相似系数之差为0.070 7，说明低剂量时改变药物的剂型，对于药效的提高更有效。

表2 各组与空白组之间的Hism函数相似系数

4 讨论

固体分散体是一种难溶性药物以分子、胶态、微晶或无定形态，分散于另一种水溶性材料中的技术，本文通过对不同比例水飞蓟素-PVP固体分散体的溶解度及体外溶出度的考察，说明PVP为一种提高水飞蓟素溶解度与溶出度的良好载体。从经济与实用的角度出发，最终选择以水飞蓟素与载体PVP比例为1∶7的固体分散体，作为小鼠急性肝损伤试验中的供试药。

CCl4在肝细胞内质网中经细胞色素P450依赖性混合功能氧化酶的代谢，生成活泼的三氯甲基自由基和氯自由基。这些自由基可与细胞内和细胞膜的大分子发生共价结合，使酶的功能丧失，细胞膜脂质过氧化，胞浆Ca2+浓度升高，导致肝细胞损伤坏死，胞浆内转氨酶渗入血液。试验中，利用CCl4致肝损伤模型中指标的测定，证明给药组对各指标都有不同程度的改善作用，固体分散体对一些指标的效果明显优于片剂。这与以往水飞蓟素对于脂质过氧化作用的对抗作用相一致，且本文将药剂学的药物体外理化性质的改变应用于药效研究，体内外的结合更加说明提高溶解度和体外溶出度对于治疗效果的影响不容忽视，这可能与药物的生物利用度得到提高有关。

Hism函数是一种新的高维数据距离函数或相似度量函数，它的优点在于在该函数中占主导地位的是那些X和Y在其上差别较小(非常靠近)的维。只要在某些维上X和Y的数值比较接近，就会表现出一定的相似性［10］。为了综合五个指标同时考虑制剂对小鼠的影响作用，本文首次利用此函数对试验所得各组数据进行进一步分析，得到各组与空白组之间的相似系数，这与预期效果相吻合。结合多个指标，用此法判断药物对症状的总体影响较为全面、具体和直观。

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