赤芍的高效液相指纹图谱及液-质联用分析

王云涛， 王莉梅， 金向群

(吉林大学药学院，吉林长春130021)

赤芍(以下简写为RPR)为毛茛科芍药(Paeonia lactiflora Pall)或川赤芍(Paeonia veitchii Lynch.)的干燥根，主产于我国东北、华北、西北等地区。研究表明，其富含的各种单萜及苷类［1-3］成分，具有抗炎［4-5］、抗病毒［6］、免疫调节［7］、解痉、镇静、保肝［8］等作用，并对心血管系统［9］、妇科疾病［10］有一定的治疗作用。鉴于赤芍药效作用广泛、成分多样，宜选用指纹图谱能够较为全面、综合地反映和控制其质量。故本实验采用RP-HPLC法建立赤芍的指纹图谱，并采用HPLCMS联用技术对赤芍的指纹图谱进行研究，将HPLC对复杂样品的高分离能力与MS的高选择性、高灵敏度以及能够提供分子量与结构信息的优点结合起来，可对赤芍质量进行比较全面的评价［11］。

1 仪器与试药

LC-10AT高效液相色谱仪(SHIMADZA);SPD-10A紫外检测器(SHIMADZA);Diamonsil® C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)(大连中汇达科学仪器公司);芍药苷标准品(购于中国药品生物制品检定所，0780-200004);赤芍药材样品(购于2007年9月，并经吉林大学药学院王广树教授鉴定)见表1。

2 方法和结果

2.1 对照品溶液的制备 精密称取在五氧化二磷减压干燥器中干燥36 h的芍药苷对照品适量，用甲醇制成0.58 mg/mL的溶液。0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2 供试品溶液的制备 精密称取赤芍药材2 g，加50%乙醇50 mL超声30 min，用50%乙醇补足重量。取续滤液25 mL，蒸干，加甲醇溶解至10 mL量瓶中，稀释至刻度，用0.45 μm微孔滤膜滤过，备用。

表1 赤芍药材样品来源Tab.1 Origins of RPR samples

2.3 色谱条件的确定 色谱柱为Diamonsil®C18(4.6 mm×250 mm，5μm)(大连中汇达科学仪器公司);流动相为A:乙腈，B:水，梯度洗脱:0 ～10 min(5%A)，10 ～20 min(10%A)，20～30 min(20%A)，30 ～40 min(20%A)，40 ～50 min(40%A)，50～60 min(5%A);流速1 mL/min;检测波长231 nm;柱温25℃;进样量为5μL;分析时间为60 min。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取同一批的赤芍药材，依照2.2项的方法配制成供试液。按选定的色谱条件连续进样5次，进行测定。记录各共有色谱峰的保留时间和积分面积。以芍药苷的保留时间和积分面积为参照，计算出各共有峰的相对保留时间、相对积分面积及它们之间的RSD值，RSD均小于3%，符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》中关于用药药材指纹图谱的规定。

2.4.2 重复性试验 取同一批的赤芍药材5份，分别依照2.2项的方法配制成供试液，进行测定并计算各共有色谱峰相对保留时间和相对峰面积及其RSD值，RSD值均不大于3%，都符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》规定，体现出色谱峰较好的一致性。

2.4.3 稳定性试验 取同一批的赤芍药材，照2.2项的方法配制成供试液。按选定的色谱条件，分别在0、4、12、24、48 h进行测定。计算各共有色谱峰相对保留时间和相对峰面积及其RSD值，RSD值均小于3%，符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》中关于用药药材指纹图谱的规定。

2.5 赤芍药材HPLC指纹图谱

2.5.1 指纹图谱及共有指纹峰的标定 根据10批供试品HPLC图谱所给出的相关参数可知，赤芍药材所有成分的色谱峰在60min内全部出现，所有谱峰都得到了较好的分离。以保留时间约为19.78 min的4号色谱峰作为参考峰(参考峰标号为S，其它特征峰依次以阿拉伯数字1，2，3…N进行标定)，计算10批样品中有9个色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值，其值均较固定(统计结果见表2和表3)，故标定为共有指纹峰。见图1和图2。

图1 赤芍药材液相色谱图Fig.1 HPLC analysis of RPR of different habitats

表2 10批赤芍药材共有指纹峰相对保留时间计算结果Tab.2 Relative retention time of common peaks for 10 batches of RPR

表3 10批赤芍药材共有指纹峰相对峰面积计算结果Tab.3 Relative areas of common peaks for 10 batches of RPR

图2 赤芍药材液相指纹图Fig.2 HPLC fingerprint spectrum of RPR

2.5.2 指纹图谱的相似度评价 本实验采用Chromap Chromafinger V0.9软件(珠海科曼中药研究有限公司)对10批赤芍药材进行数据处理，选样品l色谱图为对照，结果见表4，从相似度可以看出7个药材的相似度都在0.930以上，只有3号药材、4号药材和5号的相似度较低。这是因为共有峰与对照谱图的峰之间的这种差别而引起相似度偏低。结果表明，10个赤芍药材可以分为2类:第1类相似度在0.9～1 之间，样品有 1，2，6，7，8，9，10，可视为一类药材，为赤芍样品;第2类相似度在0.6～0.7之间，样品有3，4，5，可视为一类药材，为川赤芍。

表4 10批赤芍药材的相似度Tab.4 Degree of sim ilarity of common peaks for RPR

2.6 赤芍药材HPLC-MS定性研究 本实验通过HPLC-MSESI正离子扫描获得了赤芍指纹图谱的一些结构信息，对指纹图谱中的部分色谱峰进行了结构归属的初步判断，结合文献报道［12］，初步鉴定出5个指纹成分的化学结构，见表5，其中芍药苷通过与标准品对照HPLC保留时间得到确证。

表5 指纹图谱各个峰可能归属Tab.5 Results of HPLC-MS analysis of RPR

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

3.1.1 检测波长的选择 利用DAD检测器，对样品进行全波长扫描，确定最佳检测波长为231 nm。

3.1.2 流动相及洗脱方法的选择 通过考察甲醇-0.2%磷酸、甲醇-水、乙腈-0.2%磷酸、乙腈-水等多种流动相，最终确定流动相为:乙腈-水，通过不同比例的乙腈-水对样品洗脱能力的考察和摸索，本实验最终采用不断调节流动相比例和极性，并能达到最佳的分离效果的梯度洗脱作为实验条件。

3.1.3 流速的选择 本实验考察了不同流速(0.6，0.8，1.0，1.5 mL/min)对色谱图的影响，1.5 mL/min的流速分离效果差，0.6，0.8 mL/min的流速图谱时间过长，1.0 mL/min的流速分离效果好且时间合适，符合指纹图谱1 h的适宜时间，因此流速选择1.0 mL/min。

3.2 样品提取方法的选择 本实验分别采用超声和回流提取方法，发现两种方法所得组分相当，由于回流提取法较复杂，故本实验采用超声提取法。根据不同种醇在不同浓度时的提取结果，得出乙醇提取效率充分，且75%的乙醇提取效率最佳。最后确定样品提取方法为75%乙醇超声提取。

3.3 由于赤芍药材的主要有效成分为一些单萜及各种苷类，中国药典尤其以芍药苷为分析对象，由于芍药苷保留时间居中，且与周围色谱峰的分离度较好，峰面积较大，故以之为参照物。

3.4 为了更有效地控制赤芍药材的质量，使其符合现代中药研究及质量控制要求，本实验对该药材建立了HPLC指纹图谱，结果表明，这种方法稳定、可靠并且简便。同时充分体现其综合化、宏观化和可量化等优于其他鉴别手段的优势，该法可用以对中药材和中成药进行真伪鉴别，评价原料药材、半成品和成品质量的均一性和稳定性等。本实验同时利用HPLC-MS等手段在获得较多结构信息的同时，对赤芍化学成分进行了初步定性分析，鉴定出5个化合物，可为赤芍化学成分的进一步研究及质量控制提供参考。

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