酶降解的枸杞多糖免疫增强作用实验研究

潘志强

(江苏省镇江市第一人民医院药剂科，江苏 镇江 212002)

枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide，LBP)是枸杞子经脱脂、水提、反复醇析所得，含量为4% ～10%，是一种水溶性大分子物质，具有免疫调节、抗衰老、抗肿瘤、抗疲劳、护肝、防辐射、抗缺氧等功能，而诸多功能的发挥都源自于其对机体的免疫调节作用[1]。许多天然多糖是高分子化合物，无法通过机体屏障到达细胞而影响其生物学功能。对多糖进行降解，得到适宜相对分子质量的多糖片断或寡糖，可以提高多糖的生物活性。师然新等[2]发现，相对分子质量是影响角叉菜多糖抗肿瘤作用的重要因素，适当减小可使抑瘤率升高，但太小又会使抑瘤率迅速降低，具有适中相对分子质量的角叉菜多糖能保持高的抑瘤率，即多糖被降解至一定相对分子质量范围时能有效提高其抑瘤率。酶降解法可特异性、选择性地切断糖苷键。笔者研究了枸杞多糖经酶降解为中相对分子质量枸杞多糖后对小鼠的免疫系统的作用，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

药品与试剂:酶降解得到的中相对分子质量枸杞多糖(经糖化酶降解，多糖含量高于81%，多角度激光光散射检测器检测2个极分的重均分子质量(Mw)分别为1 7110和1 6840，由湖北大学中药生物技术省重点实验室制备;RPMI－1640培养液(GIBCO公司);小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)、SDS、环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)均为 Sigma公司产品;噻唑蓝(MTT，AMRESCO公司);印度墨水(北京笃信精细制剂厂)。ConA用pH=7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)配成100 μg/mL的溶液，避光保存备用。

动物:SPF级BALB/C小鼠160只，雌雄各半，体重18～22 g，由湖北省疾病预防控制中心实验动物研究所提供，标准小鼠饲料由实验动物研究所提供，实验动物合格证号为SCXK(鄂)2003－0005。

仪器:恒温水浴锅(北京市长风仪器有限公司);TDL－5－A型离心机(上海安亭科学仪器厂);756PC型紫外分光光度计(上海光谱仪器有限公司);电子天平;Sigma低温离心机;96孔板、酶标仪;全自动生化仪;记时秒表。

1.2 方法

1.2.1 免疫器官脏器指数测定

取40只BALB/C小鼠，雌雄各半，随机分成4组，每组10只。低、中、高剂量给药组分别给予酶降解的中相对分子质量枸杞多糖50，100，200 mg/(kg·d)，灌胃体积为 20 mL/kg，1 次 /d，连续 10 d;阴性对照组灌胃等体积生理盐水(NS)。所有动物均食用全价营养配合饲料，自由摄食饮水。末次给药12 h后，称体重后处死，取出动物的脾脏、胸腺称重，并计算脏器指数[3]。脏器指数(%)=脏器质量(g)÷动物体重(g)×100。

1.2.2 小鼠炭粒廓清试验

取40只BALB/C小鼠，雌雄各半，分组及给药处理同1.2.1项。连续给药10 d后，按每10 g体重0.1 mL计算，于小鼠尾静脉注射印度墨汁(将原液用生理盐水稀释5倍)，待墨汁注入后立即计时。分别于注射后2 min和10 min时从眼眶静脉丛取血20 μL，加入到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，以Na2CO3溶液作空白对照，于600 nm波长处测吸光度(A)值。将小鼠处死，取脾脏、肝脏，称重。计算吞噬指数(K)及校正吞噬指数(a)，表示小鼠炭粒廓清的能力[4]。吞噬指数(K)=脾重)。K为直线斜率，可表示吞噬速率;a可反映每单位组织质量的吞噬活性。

1.2.3 小鼠脾淋巴细胞转化试验(改良MTT法)

取40只BALB/C小鼠，雌雄各半，分组及给药处理同1.2.1项。末次给药4h后处死小鼠，以75%的酒精浸泡消毒，无菌条件解剖小鼠，取脾，剔除结缔组织和脂肪并剪碎脾脏后，研碎，200目细胞筛网过滤，用Hanks液洗3次，悬液收集到无菌离心管，1 500 r/min转速离心2 min，弃上清液，用Hanks液洗涤细胞2次，用RPMI－1640培养液将细胞稀释成5×106个/mL，制成单细胞悬液。每只动物的脾细胞悬液分别加12个孔，1～4孔为对照孔，加入90 μL脾细胞悬液，10 μL RPMI－1640培养液(100 IU/mL青霉素，100 μg/mL链霉素，10%小牛血清);5～8孔为加ConA孔，加入90 μL 脾细胞悬液，50 μg/mL 的 ConA 液 10 μL;9～12 孔为加LPS 孔，加入 90 μL 脾细胞悬液，100 μg/mL 的 LPS 液 10 μL。置5%CO2，37 ℃ 培养，于培养第 68 h，各孔加入 10 μL MTT 溶液(5 g/L)，继续培养4 h后，加入100 μL酸性二甲基亚砜(DMSO)溶液，振荡，于室温放置15 min，用酶标仪于570 nm波长处测定吸光度 A值。T淋巴细胞的增殖能力=ConA孔的 A值－对照孔的 A值，B淋巴细胞的增殖能力=LPS孔的 A值－对照孔的 A值。

1.2.4 环磷酰胺模型小鼠免疫功能影响试验

取40只BALB/C小鼠，雌雄各半，分组及给药处理同1.2.1项。连续给药10 d，第6天给药2 h后腹腔注射环磷酰胺(按100 mg/kg体重计算，每天重复注射同样剂量至第10天)，小鼠称重。从小鼠眼眶取血0.5 mL，放入肝素处理的离心管中进行白细胞计数;另取胸腺、脾脏称重，计算脏器指数。

1.3 统计学处理方法

2 结果

结果见表1。

表1 酶降解的LBP对小鼠免疫器官脏器指数的影响(n=10，±s)

表1 酶降解的LBP对小鼠免疫器官脏器指数的影响(n=10，±s)

注:与阴性对照组比较，△P ＜0.05，▲P ＜0.01。

B淋巴细胞增殖影响试验(A570)组别 剂量 脏器指数 炭粒廓清试验 脾脏T淋巴细胞增殖影响试验(A570)阴性对照组低剂量给药组中剂量给药组高剂量给药组等体积NS 50 mg/kg 100 mg/kg 200 mg/kg胸腺指数0.211 ± 0.062 0.252 ± 0.031 0.294 ±0.039▲0.263 ±0.045△脾指数0.481 ±0.073 0.492 ± 0.064 0.515 ± 0.065△0.561±0.073△吞噬指数 K(min－1)0.015 66 ±0.003 5 0.019 7 ±0.006 7 0.125 9 ±0.024 3▲0.032 4 ±0.002 9▲校正吞噬指数 a 3.23 ± 0.76 3.52 ± 0.88 4.87 ±0.91△4.11 ±0.78△未加ConA孔0.288 ±0.040 0.311 ± 0.009 0.309 ± 0.014 0.305 ±0.007加ConA孔0.303 ± 0.056 0.352 ± 0.038 0.391 ±0.014△0.341 ±0.009 ConA差值0.015 ±0.007 0.041 ± 0.006 0.082 ±0.011△0.036 ±0.014未加LPS孔0.259 ±0.035 0.297 ± 0.067 0.302 ± 0.041 0.324 ±0.029加LPS孔0.283 ± 0.076 0.331 ± 0.074 0.387 ±0.091△0.401 ±0.078△LPS差值0.024 ±0.005 0.034 ± 0.006 0.085 ± 0.011△0.077±0.008△

表2 环磷酰胺模型小鼠免疫功能影响试验(n=10，±s)

表2 环磷酰胺模型小鼠免疫功能影响试验(n=10，±s)

注:与模型对照组比较，□P ＜0.05，■P ＜0.01。

组别模型对照组正常对照组低剂量给药组中剂量给药组高剂量给药组药物及剂量环磷酰胺组NS 50 mg/kg 100 mg/kg 200 mg/kg白细胞数(106/mm3)3.66 ± 0.0712 9.46 ± 0.1132■5.42 ± 0.0872□6.57 ± 0.0896□5.58 ± 0.0749□胸腺指数0.091 ± 0.02 0.211 ± 0.36■0.152 ± 0.033□0.193 ± 0.035■0.164 ± 0.042□脾指数0.391 ± 0.101 0.585 ± 0.083■0.487 ± 0.054□0.575 ± 0.062■0.572 ± 0.071□

3 讨论

脾脏中以B淋巴细胞为主调节体液免疫。巨噬细胞参与机体的特异性和非特异性免疫，具有强大的杀伤和清除作用，还能分泌细胞因子调节免疫，并将抗原提呈给T及B淋巴细胞[5]。多糖的生物活性与其相对分子质量、空间构象、硫酸根含量等有关。中相对分子质量多糖的活性大于高相对分子质量和低相对分子质量多糖;具有β螺旋型立体结构的多糖有较强的抗病毒活性。可通过化学法、酶法等降解高相对分子质量的多糖，以及采用硫酸化、乙酰化等方法修饰多糖以提高其生物学活性[5]。酶降解的枸杞多糖相对分子质量由30 000降到17 000左右。本研究表明:中相对分子质量的枸杞多糖可显著增加小鼠脾脏指数;可显著增强巨噬细胞的吞噬能力，提高机体对病原微生物的抵抗力;可显著促进T及B淋巴细胞的增殖，从而增强机体的体液免疫和细胞免疫功能。另外，所有小鼠免疫试验结果均无量效依赖关系，但酶降解的枸杞多糖中剂量组效果均较好，说明多糖类都有一个最适效应量，大于这个剂量反而效果下降甚至产生免疫抑制[6－8]。另外，中相对分子质量的枸杞多糖增强了机体的特异性和非特异性免疫功能，可以增加环磷酰胺所致免疫功能低下小鼠的胸腺指数、脾指数以及提高白细胞数目，是一种具有良好开发前景的免疫调节剂。对于酶降解的中相对分子质量枸杞多糖的分子空间构象、化学修饰与免疫作用的关系，尚需深入研究。

致谢:本实验得到了湖北大学生命科学学院杜鹏副教授的热忱帮助。

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