金属离子Cu2+、Ca2+和Mg2+对抗蚜威与DNA结合作用的影响

胡 兴，张国文,*，付 鹏，占春瑞

金属离子Cu2+、Ca2+和Mg2+对抗蚜威与DNA结合作用的影响

胡 兴1，张国文1,*，付 鹏1，占春瑞2

(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.江西出入境检验检疫局，江西 南昌 330002)

在人体生理酸度(pH7.4)下，运用紫外、荧光光谱法和DNA熔点实验研究抗蚜威与小牛胸腺DNA的作用方式以及Cu2+、Ca2+和Mg2+分别对两者结合的影响。溴化乙锭(EB)竞争实验和DNA熔点测定结果表明，抗蚜威主要是通过嵌插方式与DNA碱基发生作用。3种金属离子均能与抗蚜威络合，络合物的生成使体系的紫外吸收峰强度和形状发生改变，并能不同程度地猝灭DNA-EB复合物的荧光；Cu2+、Ca2+的存在使DNA-抗蚜威复合物的结合常数呈现先减弱后增强的趋势，而Mg2+的参与能增强两者之间的结合。由此推断出，金属离子对抗蚜威与DNA结合的影响主要取决于金属离子与DNA的碱基和磷酸基团间结合的相对亲和比。

金属离子；抗蚜威；小牛胸腺DNA；荧光光谱；嵌插作用

DNA是生命遗传信息的主要载体，也是化学物质作用于生物体的一个重要靶标[1-2]。化学物质与DNA之间的非共价键结合方式主要有静电结合、沟槽结合和嵌插结合[3]。已有文献报道金属离子能够参与药物分子与DNA的结合过程[4]。Cu2+、Ca2+和Mg2+是细胞内主要的二价金属离子(Me2+)，在细胞体内充当各种重要角色，许多重要的遗传过程需要金属离子的协助才能发挥正常功能[5-7]。

抗蚜威(pirimicarb)是目前农业生产中广泛使用的一种氨基甲酸酯类农药，美国环境保护署(EPA)2008年发布的致癌可能性的农药名录，抗蚜威被列为可能对人类具有致癌性农药[8]。DNA是许多农药在体内的主要靶分子，某些农药分子通过与正常细胞DNA发生加合作用破坏其结构，进而影响基因调控与表达的功能。目前，农药抗蚜威与DNA作用方式及金属离子对抗蚜威与DNA结合的影响尚未见报道。本实验采用紫外、荧光光谱法和熔点实验，研究抗蚜威与DNA的结合作用以及Cu2+、Ca2+和Mg2+对其结合作用的影响，期望为进一步研究抗蚜威的毒性提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

抗蚜威标准品(用95%的乙醇配制，得溶液浓度为8.39×10-4mol/L，使用时根据所需进行稀释)；小牛胸腺DNA(以下简称DNA，用0.1mol/L的NaCl溶液溶解，浓度利用ε260=6600L/(mol·cm)来确定，溶液于4℃的冰箱中储备)由北京华美生物工程有限公司提供；溴化乙锭(EB)配制成1.0×10-3mol/L的水溶液，使用时根据所需进行稀释；1.0mol/L的NaCl溶液；0.05mol/L的Tris-HCl (pH7.4)缓冲溶液；其他试剂均为分析纯；实验用水均为二次蒸馏水。

F-4500型荧光光度计 日本日立公司；UV-2450紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；PHS-3C型酸度计上海雷磁仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 紫外光谱测定

在10mL的比色管中，加入4.0mL Tris-HCl缓冲溶液后再加入30μL 8.39×10-4mol/L的抗蚜威，定容至10mL混匀。移取此溶液各3mL于比色皿中，测量其紫外光谱后再逐次分别加入8μL 0.1mol/LCu2+、Ca2+和Mg2+溶液，测定紫外光谱，并扣除背景空白吸光度。

1.2.2 荧光光谱测定

在10mL的比色管中，加入4.0mL Tris-HCl缓冲溶液及20μL 8.39×10-4mol/L的抗蚜威后，再分别加入一系列浓度的Cu2+、Ca2+、Mg2+溶液，定容至10mL混匀。准确移取此溶液各3mL于荧光池中，测量其荧光强度后，分别用等量DNA(16μL/次，溶液中DNA的最终浓度为1.02×10-4mol/L)进行荧光滴定，测定其荧光强度。上述测定激发和发射狭缝均为5nm。

2 结果与分析

2.1 抗蚜威与金属离子的相互作用

图1 Cu2+(a)、Ca2+(b)和Mg2+(c)存在下抗芽威的紫外吸收光谱Fig.1 UV absorption spectra of pirimicarb in the respective presence of Cu2+, Ca2+and Mg2+and absence of metal ions

图1 是Cu2+、Ca2+、Mg2+分别加入到抗蚜威中的紫外光谱(扣除了背景空白)。Cu2+、Ca2+、Mg2+的加入均使抗蚜威体系产生不同程度的增色效应，且Cu2+的增色最大，表明3种金属离子均与抗蚜威发生了络合[9]。

2.2 金属离子、抗蚜威竞争置换EB与DNA结合实验

图2 3种金属离子对DNA-EB复合物的荧光影响Fig.2 Fluorescence spectra of the EB/DNA complex in the respective presence of Cu2+, Ca2+and Mg2+and absence of metal ion

EB是一种典型的嵌入式荧光探针，它本身的荧光强度很弱，但当其生色团平行地嵌入双螺旋DNA的碱基对中可使荧光显著增强[10]。向EB溶液中分别加入Cu2+、Ca2+、Mg2+、抗蚜威溶液时，体系的荧光光谱几乎没有发生变化，表明在实验条件下EB与金属离子和抗蚜威并不发生结合反应。而分别用3种金属离子滴定DNA-EB混合溶液，3种离子均能对DNA-EB体系的荧光产生一定程度的猝灭(图2)，猝灭程度为Cu2+＞Ca2+＞Mg2+。文献[11]报道Cu2+、Ca2+可以与DNA的磷酸基团和碱基对结合，且结合能力Cu2+＞Ca2+，而Mg2+与DNA碱基的亲和能力很小，主要是与DNA的磷酸基团结合。由本实验结果推测，Cu2+、Ca2+可能与EB竞争DNA的结合位点，而导致DNA-EB体系的荧光猝灭，荧光猝灭程度可能和金属离子与DNA碱基结合能力的强弱有关。用抗蚜威代替金属离子滴定DNA-EB混合溶液，图3表明，随着体系内抗蚜威浓度在一定范围内的增加，DNA-EB体系的荧光强度逐渐猝灭，说明抗蚜威与EB竞争结合DNA的同一位点，而置换出DNA-EB复合物中的EB，从而使体系的荧光强度降低，表明抗蚜威与DNA之间发生了嵌插作用。

图3 抗蚜威对DNA-EB复合物的荧光影响Fig.3 Fluorescence spectra of the EB/DNA complex in the presence of different concentrations of pirimicarb

2.3 熔点实验

图4 金属离子对DNA-抗蚜威熔点的影响Fig.4 Effects of Cu2+, Ca2+and Mg2+on the melting point of the EB/DNA complex

通常把DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称为该DNA的溶解温度或熔点(Tm)。小分子与DNA的相互作用对Tm有影响，嵌插结合使得DNA双螺旋结构更加稳定，Tm会增加5～8℃，而沟槽结合或静电结合对Tm影响不明显[12]。在Cu2+、Ca2+、Mg2+的人体生理离子浓度下[13]，分别测定DNA、DNA-抗蚜威体系在不同温度下的吸光度。在40～100℃温度范围内，作fss= (A－A0)/(Af－A0)对温度T的热变性曲线(图4，A0和Af分别为40℃和100℃时体系的吸光度，A为温度变化对应的吸光度)，求得DNA的Tm为67.2℃，DNA-抗蚜威体系的Tm为75℃，升高了7.8℃，进一步说明抗蚜威与DNA以嵌插方式结合，抗蚜威嵌入到DNA碱基对之间，使得DNA双螺旋结构更加稳定。Cu2+、Ca2+、Mg2+分别存在下，DNA-抗蚜威体系的Tm为78℃左右，Tm增加值小于5℃，表明3种离子的参与均未影响抗蚜威与DNA的结合方式。

2.4 金属离子对DNA-抗蚜威体系结合常数的影响

图5 不同金属离子浓度对抗蚜威-DNA体系结合常数的影响Fig.5 Effect of Cu2+, Ca2+and Mg2+at different concentrations on the binding constant of the pirimicarb/DNA complex

在不同浓度Cu2+、Ca2+、Mg2+存在下，分别用DNA滴定抗蚜威，体系的荧光光谱均发生了不同程度猝灭。采集荧光猝灭数据，由方程lg[(F0－F)/F]=lgK +nlg[Q][14]，求得不同浓度的金属离子存在下抗蚜威与DNA之间的结合常数，如图5所示。Hackl等[11]研究结果证明：Cu2+和Ca2+与DNA的磷酸基团和碱基都可以结合，且与碱基的结合能力更强。结合本实验2.2节和图5结果，可以得出当Cu2+(＜2.6 ×10-3mol/L)和Ca2+(＜2.8×10-3mol/L)处于低浓度时，Cu2+、Ca2+主要与DNA的碱基结合，它们与抗蚜威发生了竞争作用，从而减小了DNA-抗蚜威体系的结合常数。而当Cu2+(＞2.6×10-3mol/L)和Ca2+(＞2.8×10-3mol/L)处于高浓度时，Cu2+、Ca2+先与抗蚜威络合，再通过离子桥作用于DNA的磷酸基团结合，形成DNA-抗蚜威-Cu2+或DNA-抗蚜威-Ca2+复合物使结合常数明显增大；而Mg2+与DNA碱基的亲和能力很小，主要是与DNA的磷酸基团结合，当Mg2+在其与核苷酸作用的时候，嘌呤的 N7 位会取代其中一个水配体，其余水配体能与磷酸上的氧以及嘌呤C6位上的O形成氢键[15]，Mg2+的参与有利于DNA的双螺旋打开，从而促进抗蚜威与DNA的结合，表现为增大了抗蚜威与DNA的结合常数[16]。

3 结 论

紫外光谱表明，Cu2+、Ca2+和Mg2+都能与抗蚜威络合，EB竞争实验和DNA熔点实验表明，抗蚜威与DNA以嵌插方式结合。金属离子对DNA-抗蚜威结合的影响程度主要取决于金属离子与DNA碱基和磷酸基团间结合的相对亲和比。当Cu2+、Ca2+在低浓度时，其主要与DNA的碱基结合，此时Cu2+、Ca2+通过竞争抗蚜威与DNA的结合位点而导致DNA-抗蚜威之间的结合常数降低，在高浓度时通过Cu2+、Ca2+离子桥作用增大了DNA-抗蚜威之间结合常数，而Mg2+主要与DNA的磷酸基团结合，Mg2+浓度的增加能增加抗蚜威与DNA之间的结合常数。

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Effects of Cu2+, Ca2+and Mg2+on the Interaction of Pirimicarb with Calf Thymus DNA

HU Xing1，ZHANG Guo-wen1,*，FU Peng1，ZHAN Chun-rui2
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. Jiangxi Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Nanchang 330002, China)

The interaction between pirimicarb and calf thymus DNA was studied by UV absorption spectroscopy, fluorescence spectroscopy and melting point measurement in the respective presence of Cu2+, Ca2+and Mg2+in physiological buffer (pH 7.4). From the results of ethidium bromide (EB) competition and DNA melting point measurement, pirimicarb reacted with DNA basic groups mainly through intercalative binding. All the three metal ions were found to be able to complex with pirimicarb, and the generation of complexes made a difference to the ultraviolet absorption peak intensity and shape of the reaction systems and quenched the fluorescence intensity of the EB/DNA complex to different extents. In the respective presence of Cu2+and Ca2+, the binding constant of the DNA/pirimicarb complex initially decreased, followed by increase, and the involvement of Mg2+could enhance the binding between DNA and pirimicarb. It can be concluded that the binding between DNA and pirimicarb mainly depends on the relative affinity ratio between metal ions and DNA basic groups or phosphate groups.

metal ions；pirimicarb；calf thymus DNA；fluorescence spectrum；intercalative binding

O657.3

A

1002-6630(2010)19-0146-04

2010-06-20

国家自然科学基金项目(31060210)；江西省科技支撑计划项目(2009BNA09000)；国家质检总局科技项目(2009IK141)；南昌大学食品科学与技术国家重点实验室目标导向项目(SKLF-MB-200807)

胡兴(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为食品安全。E-mail：hx0726@126.com

*通信作者：张国文(1966—)，男，教授，博士，研究方向为食品化学与食品安全。 E-mail：gwzhang@ncu.edu.cn