苦菜不同部位提取物的抗氧化活性

韩阳阳，王天晓，朱海芳，王 玮，王建华,*

苦菜不同部位提取物的抗氧化活性

韩阳阳1，王天晓2，朱海芳1，王 玮1，王建华1,*

(1.山东农业大学生命科学学院，山东 泰安 271017；2.厦门大学材料学院，福建 厦门 361005)

分别用水、乙醇(体积分数分别为25%、50%、75%)和无水乙醇，对苦菜的根、茎、叶、花4个部位进行冷浸提取。测定不同处理条件下的提取率，并用DPPH自由基清除法检测提取物的抗氧化活性；测定提取物的总黄酮和总多酚类物质的含量及其EC50。结果表明：用50%乙醇提取的苦菜各部位提取率最高，不同部位不同溶剂提取物的抗氧化活性均呈明显的剂量关系；提取物的抗氧化活性与其中总黄酮和总多酚的含量有关；不同部位的抗氧化能力大小为：花＞叶＞茎＞根。

苦菜；总黄酮；总多酚；抗氧化活性

苦菜(Sonchus oleraceus L.)为菊科苦苣属的一年生或两年生草本植物，又名苦荬菜、苣荬菜[1]。苦菜含有多种营养和功能成分，是一种药食同源的植物，我国民间食用苦菜已有2000多年的历史。现代医学证明，长期食用苦菜及其制品可预防肿瘤、养血保肝、消炎利胆、降压降脂、增强人体免疫力等[2]，尤其是对糖尿病、心脑血管病、动脉硬化等多种中老年疾病以及由细菌引起的各种炎症、失眠、神经衰弱等疾病都有很好的预防和治疗作用。卢新华[3]和李美化[4]等的实验证明，苦菜有明显的抗氧化作用，但有关其不同部位的抗氧化活性鲜见报道。本研究采用不同体积分数乙醇溶液冷浸提取苦菜不同部位的抗氧化物质，用DPPH自由基清除法对提取物的抗氧化活性进行测定，并测定提取物中的总黄酮和总多酚含量，旨在为为苦菜的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验所用苦菜于2009年5月采自于山东农业大学药用植物标本园，苦菜种植生长为粗放型常规管理。

DPPH(1,1-二苯基-2-苦基肼自由基)、原儿茶素标准品、没食子酸标准品 Sigma-Fluka 公司；无水乙醇、钨酸钠、钼酸钠、磷酸、浓盐酸、硫酸锂、碳酸钠、氢氧化钠、亚硝酸钠、三氯化铝等均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-2450型紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；BT 25S型电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；YP2002型电子天平 上海越平科学仪器有限公司；KQ-250DE型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒实验仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 苦菜不同部位抗氧化物质的提取

将苦菜各部位(根、茎、叶、花)分开，用自来水迅速冲洗干净并用吸水纸吸干表面水分，超低温保存备用。用电子天平准确称取20g上述备用的苦菜根样品，分别加入去离子水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇和无水乙醇各150mL，室温下冷浸提取24h，倒出提取液，再续加溶剂150mL，如此反复提取3次，合并提取液。将所得提取液放入水浴锅内，于60℃浓缩至基本无液体状态，放入干燥箱内在60℃条件下烘干至质量恒定，然后加入适量上述对应的乙醇溶液(约15mL)，超声溶解后，转移至容量瓶内，定容至25mL，备用。

苦菜茎、叶、花的材料处理与提取方法与苦菜根相同。

1.3.2 总黄酮含量的测定

[5]，以儿茶素为标准品绘制标准曲线，得到吸光度(A)与儿茶素含量(Y)的关系曲线的回归方程：A=5.5615Y+0.00442，R2=0.99910。用此方程式计算出不同体积分数乙醇处理的苦菜不同部位提取物中总黄酮的含量。

1.3.3 总多酚含量的测定

Folin-Ciocalteu试剂的制备参考文献[6]。

标准曲线的制备参考文献[7]，稍作改动。准确吸取质量浓度为0.02mg/mL没食子酸标准溶液0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8mL于10mL容量瓶中，加入Folin-Ciocalteu试剂1.80mL，混匀，再加入3mL Na2CO3(20g/100mL)，加离子水补足体积至10mL，室温反应2h，于765nm波长处测定吸光度。得到吸光度(A)与没食子酸含量(Y)的关系曲线的回归方程：A=0.21290Y+0.01537，R2=0.9987。

用此方程式计算出不同体积分数乙醇溶液提取的苦菜不同部位提取物中总多酚的含量，以没食子酸的相对量表示总多酚的含量。

1.3.4 苦菜不同部位提取物的抗氧化活性测定

DPPH溶液的配制：用万分之一电子天平准确称取DPPH标准品0.14712g，用95%乙醇定容至100mL，得质量浓度为147.12mg/mL(约3.678×10-3mol/L)的DPPH储备液，置于冰箱中冷藏备用。

准确量取适量样品于试管内，加入DPPH溶液0.20mL，用无水乙醇定容至10mL，室温反应30min，用紫外分光光度计在517nm波长处测定混合溶液的吸光度(A1)。同时准确量取DPPH溶液0.20mL，用无水乙醇准确定容至10mL，室温反应30min，用紫外分光光度计在517nm波长处测定混合溶液的吸光度(A0)。用下列公式计算提取液对DPPH自由基的清除率(%)[8]。

1.3.5 半数有效浓度(EC50)的计算

参考文献[9]，根据各样品清除DPPH自由基的曲线，计算得到DPPH的原始浓度减少一半时各提取物的添加量(EC50)，根据EC50的大小判断不同提取物清除自由基的能力，EC50越小其清除自由基的能力越强。

2 结果与分析

2.1 不同体积分数乙醇对苦菜各部位的提取率

表1 不同体积分数乙醇对苦菜各部位的提取率Table 1 Extraction efficiencies of ethanol soluble substances from different parts of Sonchus oleraceus L. using water and different concentrations of ethanol

由表1可知，在其他条件均相同的前提下，根在用25%乙醇和50%乙醇处理时提取率最大，为11.7%，随着乙醇体积分数的提高，提取物质的总量逐渐降低。茎、叶和花的最大提取率均是在用50%乙醇处理时，分别为5.5%、7.1%和11.8%，用25%乙醇处理时的提取率与50%乙醇处理时提取率相差不大。

2.2 苦菜各部位提取物对DPPH自由基的清除率

2.2.1 苦菜根提取物的DPPH自由基清除率

表2 苦菜根提取物的DPPH自由基清除率Table 2 DPPH free radical scavenging rates of extracts of Sonchus oleraceus L. roots at different concentrations

由表2可知，苦菜根的乙醇溶液提取物各质量浓度对DPPH自由基均有一定的清除活性，并且清除率与提取物的质量浓度呈现剂量关系，其清除率随提取物质量浓度的增大而提高，在质量浓度为13.6mg/mL时，各提取物的清除率均最大。不同质量浓度乙醇提取物在相同的提取物质量浓度条件下清除率也有很大不同，其中去离子水提取物和25%乙醇提取物的清除活性相差很小，75%乙醇提取物在各质量浓度条件下对DPPH自由基的清除率均大于其他处理的提取物，其次是50%乙醇提取物。

2.2.2 苦菜茎提取物的DPPH自由基清除率

表3 苦菜茎提取物的DPPH自由基清除率Table 3 DPPH free radical scavenging rates of extracts of Sonchus oleraceus L. stems at different concentrations

由表3可知，与苦菜根相同，苦菜茎的各质量浓度乙醇溶液提取物对DPPH自由基均有清除活性，并且呈现剂量关系。在质量浓度为9.6mg/mL时，各处理的清除率均最大。在相同的提取物质量浓度条件下，茎不同体积分数乙醇提取物的清除活性也有很大不同。总体来看，在各质量浓度条件下，去离子水提取物对自由基的清除率均最大。

2.2.3 苦菜叶提取物的DPPH自由基清除率

表4 苦菜叶提取物的DPPH自由基清除率Table 4 DPPH free radical scavenging rates of extracts of Sonchus oleraceus L. leaves at different concentrations

由表4可知，苦菜叶的各质量浓度乙醇溶液提取物对DPPH自由基也同样有清除作用，并且呈现剂量关系。在质量浓度为3.2～4.8mg/mL之间，25%乙醇提取物的清除率最大。75%乙醇提取物的清除率在质量浓度为4.0mg/mL达到最大值后稍有下降，这可能与反应生成沉淀有关。所有处理中，无水乙醇提取物清除率在各个质量浓度中均为最低。

2.2.4 苦菜花提取物的DPPH自由基清除率

由表5可知，苦菜花的各质量浓度乙醇溶液提取物对DPPH自由基同样有清除作用，并且呈现剂量关系。在测定的质量浓度范围内，各提取物对自由基清除率的总体变化趋势为：75%乙醇＞50%乙醇＞无水乙醇＞去离子水＞25%乙醇。

表5 苦菜花提取物的DPPH自由基清除率Table 5 DPPH free radical scavenging rates of extracts of Sonchus oleraceus L. flowers at different concentrations

2.3 不同体积分数乙醇对苦菜不同部位总黄酮和总多酚的提取效果及半数有效浓度的分析

表6 苦菜不同部位提取物中总黄酮、总多酚的含量及EC50Table 6 Contents of total flavonoids and total polyphenols and EC50for scavenging DPPH free radicals of extracts from different parts of Sonchus oleraceus L.

由表6可知，在各乙醇体积分数条件下，苦菜不同部位间的总黄酮含量大小为：花＞叶＞茎＞根。用不同体积分数乙醇提取相同部位，所得总黄酮含量差异较大。在根中，前4个处理的总黄酮含量随乙醇体积分数的提高逐渐增大，75%乙醇提取物所得总黄酮含量最高，但用无水乙醇提取时总黄酮含量急剧下降。在茎中，总黄酮的含量随着乙醇体积分数的提高呈先降低后升高的趋势，用无水乙醇做提取剂时含量达到最高，而用25%乙醇提取时含量最低。在叶中，无水乙醇提取物中总黄酮含量最高，其次是去离子水提取物时，二者相差很小。在花中，各提取物中总黄酮含量的变化趋势与茎类似。

与总黄酮含量类似，不同部位间总多酚含量也有很大差异，呈现花＞叶＞茎＞根的趋势。用不同体积分数乙醇提取的总多酚含量差异很大。在根中，用25%乙醇提取的总多酚含量最高，其次是去离子水。在茎中，总多酚含量随着乙醇体积分数的提高逐渐降低，含量最高的是去离子水提取物，最低的是无水乙醇提取物。在叶中，同样是去离子水提取的总多酚含量最高，其他处理的总多酚含量依次为50%乙醇提取物＞75%乙醇提取物＞25%乙醇提取物＞无水乙醇提取物。在花中，总多酚含量最高的是50%乙醇提取物，其次是去离子水和75%乙醇提取物的。

以总黄酮(总多酚)含量为横坐标，EC50为纵坐标进行线性回归分析，结果表明：苦菜不同部位的EC50大小与其中的总黄酮和总多酚含量有一定的相关性。其中EC50与总黄酮含量符合一元一次方程模型，其方程分别为：根：Y=－4.5722X＋14.75，R2=0.8985；茎：Y=1.9507X－1.1836，R2=0.6359；叶：Y=0.0841X＋0.8364，R2=0.0352；花：Y=－0.0443X＋1.3397，R2=0.3559。EC50与总多酚含量也符合一元一次方程模型，其方程分别为：根：Y=－0.0056X＋11.719，R2= 0.0507；茎：Y=－0.0207X＋15.112，R2=0.8879；叶：Y=－0.004X＋6.1556，R2=0.6762；花：Y=－0.0014X＋3.0798，R2=0.5171。总体来说，不同部位EC50的大小顺序为：根＞茎＞叶＞花。

3 结 论

自由基是机体正常代谢的产物，对维持机体正常新陈代谢起着一定的促进作用。正常情况下机体内自由基的产生与清除处于动态平衡之中，产生过多或清除过慢，均会给机体造成不利的影响。随着年龄的增长，机体内产生自由基清除物质的能力逐渐下降，导致自由基过剩，加速生命的衰老并导致一系列的疾病，是诱发肿瘤、心血管疾病等恶性疾病的重要原因。自由基清除物质能够清除机体代谢过程中产生的过多自由基，达到预防和消除疾病的作用，从而增进机体的健康。蔬菜作为日常膳食的重要组成部分，对于维护机体自由基动态平衡具有非常积极的意义[10]。从天然食品中寻找和发现具有较好自由基清除作用的功能因子已成为现代食品研究和开发的重要内容[11-12]。

多酚类化合物是指分子结构中有若干个酚性羟基的植物成分的总称，按结构分为酚酸(phenolic acids)、类黄酮(flavonoids) 以及不常见的1,2-二苯乙烯(stilbenes) 和木酚素(lignans)。它存在于一些常见的植物性食物中[13]。黄酮类化合物广泛存在于植物界，是一类有强抗氧化活性的植物次生代谢多酚，是许多中草药的有效成分，有广泛的药理作用[14]。在自然界中最常见的是黄酮和黄酮醇。本实验结果证明：用不同体积分数乙醇冷浸提取苦菜各部位，获得的提取物总量有差异，总体来看，以50%乙醇体积分数获得的提取物最多(表1)。检测不同体积分数乙醇提取物的抗氧化活性时，在提取物质量浓度相同的条件下，不同体积分数乙醇的提取物的抗氧化效果不同。用不同体积分数乙醇浸提苦菜各部位，提取液中总黄酮和总多酚含量不同，提取液中多酚类物质的含量显著高于黄酮类(表6)。

线性回归分析结果表明：提取液对DPPH自由基的清除能力与其中总黄酮和总多酚类物质的含量有一定相关关系，但根中的总多酚含量与EC50相关性不大，这可能是由于除总多酚外，根提取液中还有其他有效成分对DPPH自由基起清除起作用[15]。除此之外，苦菜的根、茎、叶、花各部位对DPPH自由基均有一定的清除能力，其中花提取物的清除能力最强，其次是叶，根的清除能力最弱。

本实验主要测定了苦菜不同部位的抗氧化能力大小及其中黄酮类和多酚类物质与其抗氧化能力之间的关系，植物中的抗氧化物质不仅包括以上两种，还有维生素类、生物碱类、皂苷类等物质[16]，它们与苦菜抗氧化能力之间的关系有待于进一步研究。

参考文献：

[1]陈辉, 苏娜, 张苑. 苦菜的开发与利用[J]. 食品研究与开发, 2004, 25 (2): 89.

[2]王二霞, 赵健, 琚争艳, 等. 苦菜及其研究开发现状[J]. 食品工程科技, 2008, 29(10): 272-273.

[3]卢新华, 谷彬, 刘思妤. 苦菜体内外抗氧化作用的实验研究[J]. 右江医学, 2007, 35(2): 120-122.

[4]李美仙, 许秀举, 李桂兰. 苦菜茶对大鼠血清GSH-PX活性的影响[J].包头医学院学报, 2005, 21(3): 231-232.

[5]KIMA D K, JEONGB S W, LEEA C T. Antioxidant capacity of phenolic phytochemicals from various cultivars of plums[J]. Food Chemistry, 2003, 81: 321-326.

[6]SLINKARD J, SINGLETON V L. Total phenol analysis: automation and comparison with manual methods[J]. American Journal of Enology and Viticulture, 1977, 28: 49-55.

[7]郭娟, 艾志录, 崔建浩, 等. 苹果渣中多酚物质的福林法测定[J]. 食品工业科技, 2006, 27(2): 178-180.

[8]邱金东, 汤昆. DPPH和ABTS法测定核桃仁的体外抗氧化活性[J].中成药, 2008, 30(8): 1215-1216.

[9]曲欢欢, 李白雪, 燕菲, 等. 用清除有机自由基DPPH 法评价连翘不同部位抗氧化作用[J]. 中国中医药信息杂志, 2008, 15(5): 32-34.

[10]UZOGARA S G. The impact of genetic modification of human foods in the 21st century: A review[J]. Biotechnology Advances, 2000, 18(3): 179-206.

[11]FRUSCIANTE L, BARONE A. Evaluation and use of plant biodiversity for food and pharmaceuticals[J]. Fitoterapia, 2000, 71(1): 66-72.

[12]MILLER H E, RIGELHOF F, MARQUART L, et al. Antioxidant content of whole grain breakfast cereals, fruits and vegetables[J]. Journal of the American College of Nutrition, 2000, 19(3): 3l2-315.

[13]郭长江, 韦京豫. 食物多酚类物质的种类、膳食摄入量与生物利用率[J]. 营养健康新观察, 2003(2): 28-30.

[14]闵巍巍, 张作法. 黄酮类化合物的药理作用[J]. 蚕桑通报, 2007, 38 (4): 1-3.

[15]PIETTA P G. Flavonoids as antioxidants[J]. Journal of Natural Products, 2006, 63: 1035-1042.

[16]赵艳红, 李建科, 赵维, 等. 常见药食植物提取物体外抗氧化活性的评价[J]. 食品科学, 2009, 30(3): 104-108.

Antioxidant Activity Assessment of Extracts from Different Parts of Sonchus oleraceus L.

HAN Yang-yang1，WANG Tian-xiao2，ZHU Hai-fang1，WANG Wei1，WANG Jian-hua1,*
(1. College of Life Science, Shandong Agricultural University, Tai， an 271017, China；2. College of Materials, Xiamen University, Xiamen 361005, China)

Four different parts of Sonchus oleraceus L. (root, stem, leaf and flower) were extracted separately with water and different concentrations of ethanol (25%, 50%, 75% and 100%) under room temperature. The calculation of extraction efficiency was performed, and the resultant extracts were tested for their DPPH radical scavenging capacity (EC50, half maximal effective concentration) and the contents of total flavonoids. Fifty percent ethanol gave the highest extraction efficiency of ethanol soluble substances from each of these four parts of Sonchus oleraceus L. Different extracts from different parts of Sonchus oleraceus L. all had significantly dosage-dependent antioxidant activity, which was related to the contents of total flavonoids and total polyphenols. The order of antioxidant activity for these four parts was: flower ＞ leaf ＞ stem ＞ root.

Sonchus oleraceus L.；total flavonoids；total polyphenols；antioxidant activity

Q949.95

A

1002-6630(2010)19-0045-04

2009-12-20

泰安市2007中药现代化科技专项(5012100999)

韩阳阳(1987—)，女，硕士研究生，主要从事植物学研究。E-mail：hanyy2009@163.com

*通信作者：王建华(1963—)，男，教授，博士，主要从事植物资源研究与开发。E-mail：jiwangjh@163.com