香薷多糖的乙醇分级纯化及其性质

李卷梅，聂少平*，李景恩，李 昌，谢明勇

香薷多糖的乙醇分级纯化及其性质

李卷梅，聂少平*，李景恩，李 昌，谢明勇

(南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047)

采用热水浸提法从香薷中得到多糖提取物，然后采用乙醇分级沉淀法纯化香薷多糖，收集得到乙醇体积分数为20%、30%、40%、50%、60%、70%条件下析出的多糖沉淀物。之后经Sevag法脱除多糖中的游离蛋白，得到纯化后的6个香薷多糖组分HMP-1、HMP-2、HMP-3、HMP-4、HMP-5和HMP-6。应用紫外和红外光谱检测HMP-1、HMP-2、HMP-3、HMP-4、HMP-5和HMP-6的光谱性质，测定糖含量、可溶性蛋白质含量和糖醛酸含量，并用气相色谱法测定单糖组成。结果表明：HMP-1、HMP-2、HMP-3、HMP-4、HMP-5和HMP-6均为酸性多糖，蛋白含量较高。HMP-1和HMP-2主要含有阿拉伯糖和葡萄糖，HMP-3主要含有阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和核糖，HMP-4主要含有阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖，HMP-5和HMP-6主要含有阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖。此外，6个多糖组分均含有少量的鼠李糖、木糖，但单糖间物质的量比相差较大。

香薷多糖；乙醇分级沉淀；理化性质；光谱性质；单糖组成

香薷(Herba Moslae)为传统的辛温解表中药，被卫生部列为药食两用资源目录之中，全草能发汗解表，利水消肿，调中温胃止呕，最早记载于《名医别录》，列为中品，又名香柔[1]。香薷属多年生草本，在我国分布广泛，全国香薷类商品药材主要为“江香薷”和“青香薷”[2]。过去香薷的化学成分研究仅限于挥发油成分，其挥发油具有解热、阵痛、免疫增强、抗菌及抗病毒作用[3]。

江香薷是江西的地道药材，栽培历史悠久，主要分布于新余市、樟树市、分宜县、渝水区等地。目前国内外对香薷多糖的研究报道较少，本实验对从江西樟树产的江香薷用热水浸提得到香薷多糖，采用乙醇分级沉淀法进行纯化得到不同多糖组分，测定其糖含量、可溶性蛋白含量以及糖醛酸含量，结合紫外、红外光谱考察其光谱性质，并用气相色谱法分析其单糖组成。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香薷采自江西省樟树市中药材市场，经鉴定为唇形科植物江香薷，粉碎后过20目筛。

D-核糖、D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖、D-半乳糖醛酸、L-鼠李糖和L-岩藻糖 上海国药试剂公司；牛血清白蛋白 Amersco公司；考马斯亮蓝G-250(进口分装) Fluka公司；浓硫酸、无水乙醇、氯仿、正丁醇、三氟乙酸、乙酸酐、吡啶、咔唑、苯酚、盐酸羟胺、葡萄糖等均为国产分析纯。1.2仪器与设备

ALPHA 1-2 冷冻干燥机 德国Martin Christ公司；GC(6890N) 美国Agilent Technologies公司；TU-1900双光束紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；Nicolet FT-IR 5700型傅里叶红外光谱仪 Thermo Electron 公司；AL 104电子天平 上海梅特勒-托利仪器公司；EYELAN-1001旋转蒸发仪 上海爱朗仪器有限公司；SHZ-ⅢB循环水真空泵 上海亚荣生化有限公司；TDL-5型离心沉淀机 上海飞鸽系列离心机厂；HH-4数显恒温水浴锅 上海国华电器有限公司；Milli-Q超纯水仪 美国Millipore公司；透析袋(8000～10000D)美国Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 香薷多糖水提物的制备

称取已粉碎过筛的香薷100g，用800mL 体积分数为80%的乙醇浸泡24h脱除脂溶性物质，双层滤布过滤。滤渣置于50℃烘箱中挥干乙醇[4]。干燥后，加1500mL蒸馏水，于87℃水浴回流提取4h[5]，4800r/min离心分离10min，双层滤布过滤。滤渣重复提取一次，合并滤液，旋转蒸发浓缩，得到香薷多糖水提物。

1.3.2 香薷多糖的乙醇分级沉淀

将多糖水提物依次用体积分数为20%、30%、40%、50%、60%、70%的乙醇于4℃层析冷柜中分级沉淀12h，离心，沉淀用无水乙醇洗涤两次。自然风干乙醇后，用Sevag法[6](氯仿与正丁醇体积比为4:1)脱蛋白，反复进行两次。然后用流动自来水透析48h，蒸馏水透析24h[7]，透析液浓缩后冷冻干燥得香薷多糖组分(HMP-1、HMP-2、HMP-3、HMP-4、HMP-5和HMP-6)，备用。

1.3.3 基本理化指标测定

以鼠李糖为标准，苯酚-硫酸法测定总糖含量[8]；以牛血清白蛋白为标准，考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量[9]；以半乳糖醛酸为标准，硫酸-咔唑法测定糖醛酸含量[10]。

1.3.4 紫外光谱分析

将质量浓度为0.1mg/mL的多糖样品溶液置于紫外-可见分光光度计中于190～400nm的波长范围进行光谱扫描[11]。

1.3.5 红外光谱分析

称取干燥样品1mg，与约100mg KBr研磨后，KBr封闭样品颗粒，制成透明压片，用傅里叶变换红外光谱仪在400～4000cm-1区内进行光谱扫描[12]。

1.3.6 单糖组成分析

称取10mg样品于安培管中，加入2mL浓度为2mol/L的三氟乙酸，真空封管，100℃下水解8h[13]。水解后，样品冷却至室温，于70℃水浴用氮气吹干三氟乙酸，得到多糖水解物。

称取8种标准单糖(鼠李糖、核糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖)各2mg于样品管中，加入10mg盐酸羟胺，0.5mL吡啶溶解。加塞，于90℃恒温水浴振荡30min。冷却至室温，加入0.5mL乙酸酐。加塞，于90℃恒温水浴振荡30min[14]。冷却至室温，用有机膜过滤，得到糖腈乙酸酯衍生物。将多糖水解物按照相同方法进行衍生。气相色谱仪工作参数见表1。

表1 气相色谱仪工作参数Table 1 GC instrumental parameters

2 结果与分析

2.1 基本理化指标测定

由表2可知，HMP-1、HMP-2、HMP-3、HMP-4、HMP-5和HMP-6的糖含量均不高，最多为43.06%，最少为28.72%。HMP-2的糖醛酸含量最高，达到51.71%；HMP-5的糖醛酸含量最低，只有9.44%。除HMP-6，其余5个多糖组分的蛋白质含量均在11%～20%之间。由于用Sevag法基本脱除了游离蛋白，所以样品中的蛋白质应为与多糖结合紧密的结合蛋白。HMP-2是得率最高的多糖组分，其中的杂质较少，糖、糖醛酸、蛋白质三者加起来含量超过96%。HMP-3的得率其次，其杂质含量也较少。因此，在后续实验中将对HMP-2和HMP-3这两个组分进行深入分析。其余组分的杂质较多，考虑为灰分和结合水。

表2 HMP化学组成分析Table 2 Chemical composition analysis of HMP-1 through 6

2.2 紫外光谱扫描

图1 HMP紫外可见扫描光谱Fig.1 UV absorption spectra of HMP-1 through 6

由图1可知，6种多糖在260nm波长处均没有吸收峰，说明不含核酸成分；在280nm波长处略有吸收，且从HMP-1至HMP-6，280nm波长处吸收程度逐渐增大，这与用考马斯亮蓝染色法测得的蛋白含量趋势一致。2.3红外光谱扫描

图2 HMP-1、HMP-2、HMP-3红外光谱图Fig.2 IR spectra of HMP-1, 2 and 3

图3 HMP-4、HMP-5、HMP-6红外光谱图Fig.3 IR spectra of HMP-4, 5 and 6

红外光谱可以进行一些复杂化合物的定性及定量分析，检验分子中一些官能团和氢键的存在。红外光谱法不破坏样品，这对于极难获得的糖的微量样品尤为重要[15]。6种多糖的红外扫描结果见图2、3。

在3400cm-1左右出现的宽峰为羟基的O－H伸缩振动或氨基的N－H伸缩振动[16]，O－H伸缩振动和N－H伸缩振动往往相互叠加，难以区分。若为O－H伸缩振动，则当部分羟基被取代时，该峰会减弱[15]。从HMP-1、HMP-2、HMP-3、HMP-4、HMP-5和HMP-6分别在3384.2、3419.4、3418.4、3421.0、3374.5、3381.0cm-1的吸收强度可以看出，HMP-1和HMP-6的羟基较多，其余4个组分的羟基较少。在2923cm-1附近(2927.9、2930.9、2932.3、2930.2、2930.1、2941.7cm-1)出现的弱吸收峰为糖环中的C－H伸缩振动[17]。1400～1200cm-1之间的吸收峰是糖类化合物的C－H变角振动。由此可以初步判定，6个组分均为多糖。

1650～1500cm-1之间的吸收峰是氨基的N－H变角振动[15]，由此证明6种多糖应该含有蛋白质。对于HMP-5和HMP-6，在1650～1500cm-1区域比其他组分多一个吸收峰，这可能由于其蛋白质含量较高引起。鉴于6种多糖在1650～1620cm-1之间均没有吸收峰，因此它们应该不含有酰胺基。

在1410cm-1左右出现的吸收峰为羧基的C－O伸缩振动，在1320～1210cm-1之间的一组吸收峰为羧基的O－H变角振动[15]，由此可以判断6种多糖含有羧基。值得注意的是，HMP-2在1741.1cm-1处有一吸收峰，这可能为乙酰酯基或醛基的C=O伸缩振动，而在之前的化学组成测定中发现HMP-2的糖醛酸含量最高，因此为醛基的C=O伸缩振动的可能性更大。

1200～950cm-1区域内比较大的吸收峰是由两种C－O伸缩振动引起的，一种是属于C－O－H的，另一种是属于糖环C－O－C的[18]。HMP-1在1151.1cm-1和1026.7cm-1处的两个吸收峰可能为果胶的吸收峰，而根据HMP-2在1741.1、1619.1、1103.0、1016.6cm-14处的吸收峰判断该组分极有可能含有果胶[19]，这符合之前的糖醛酸测定结果。

HMP-1和HMP-2同时在767cm-1处出现的吸收峰是由对称吡喃环的伸缩振动引起；HMP-2和HMP-3分别在910.4、906.8cm-1处的吸收峰应该是β-D-半乳吡喃糖的特征吸收；HMP-2在832.5cm-1处的峰可能是α-甘露吡喃糖或者β-阿拉伯吡喃糖的特征吸收；HMP-3在819.2cm-1处的峰可能是α-甘露吡喃糖的特征吸收或者呋喃环的C－H变角振动；HMP-4在898.8cm-1处的峰是β-D-甘露吡喃糖的特征吸收；HMP-5和HMP-6分别在782.3、807.8cm-1处的吸收峰应该为呋喃环的C－H变角振动[15]；HMP-1、HMP-2、HMP-3、HMP-5和HMP-6在600cm-1附近的一组峰为O－H的面外振动[20]。

2.4 单糖组成

标准单糖衍生物的气相色谱图见图4，HMP-1、HMP-2、HMP-3、HMP-4、HMP-5和HMP-6的单糖组成见表3。从图4可以看出，除岩藻糖衍生物和阿拉伯糖衍生物没有完全分离外，其他6种单糖衍生物得到较好分离。

图4 标准单糖衍生物的气相色谱图Fig.4 GC chromatogram of monosaccharide standard derivatives

3 结 论

本研究首次用乙醇分级沉淀的方法纯化香薷多糖并研究其理化性质。结果表明：HMP-1、HMP-2、HMP-3、HMP-4、HMP-5和HMP-6糖含量中等，均有一定量的糖醛酸和蛋白质，这与光谱分析结果一致。气相色谱分析表明，HMP-1、HMP-2、HMP-3、HMP-4、HMP-5和HMP-6主要含有葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖，此外还有少量的甘露糖、木糖、鼠李糖和核糖。

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Ethanol Fractional Precipitation and Characterization of Polysaccharides from Herba Moslae

LI Juan-mei，NIE Shao-ping*，LI Jing-en，LI Chang，XIE Ming-yong
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

A polysaccharide-rich extract was obtained from Herba Moslae by hot water extraction and purified by fractional precipitation with gradient concentrations of ethanol (20%, 30%, 40%, 50%, 60% and 70%). The separated fractions were deproteinized by Sevag method and six purified polysaccharide fractions, named HMP-1 through 6 were obtained. These fractions were subjected to UV-visible spectral analysis, the determination of sugar, soluble protein and uronic acid contents and monosaccharide composition analysis by gas chromatography (GC). Each of these fractions was an acidic polysaccharide, with high protein content. Arabinose and glucose were the main monosaccharides in HMP-1 and HMP-2, arabinose, glucose, galactose and ribose were the main monosaccharides in HMP-3, arabinose, glucose and galactose were the main monosaccharides in HMP-4, and arabinose, glucose, galactose and mannose were the main monosaccharides in HMP-5 and HMP-6. In addition, small amounts of rhamnose and xylose were also detected in each of the six fractions.

polysaccharides from Herba Moslae；ethanol fractional precipitation；physico-chemical properties；spectral properties；monosaccharide composition

TQ929.2

A

1002-6630(2010)19-0182-04

2010-06-27

食品科学与技术国家重点实验室目标导向项目(SKLF-MB-200806)；江西省青年科学家井冈之星；远航工程项目

李卷梅(1987—)，女，硕士研究生，研究方向为食品科学。E-mail：lijuanmei_ncu@hotmail.com

*通信作者：聂少平(1978—)，男，副教授，博士，主要从事食品科学与工程、食品营养与安全及糖化学与糖生物学研究。E-mail：spnie@ncu.edu.cn