木香倍半萜对血管内皮细胞生长因子的抑制作用

郝立杰,赵 烽,高治廷,许 卉,刘 珂

1烟台大学药学院,烟台 264005;2烟台赛尔斯生物技术有限公司,烟台 264006

木香倍半萜对血管内皮细胞生长因子的抑制作用

郝立杰1,2,赵 烽1＊,高治廷1,许 卉1,刘 珂1

1烟台大学药学院,烟台 264005;2烟台赛尔斯生物技术有限公司,烟台 264006

对 EL ISA法测定人血管内皮细胞生长因子(human VEGF)的检测条件进行研究,考察了酶标板种类、一抗包被时间、紫外辐照等对酶联免疫反应的影响,优化了检测条件:可采用广州洁特公司生产的酶标板替代进口 Costar酶标板,一抗包被时间 24 h,一抗包被前紫外辐照 30 min可明显提高酶标板对包被抗体的亲和力。利用优化的检测条件测定了木香挥发油、土木香挥发油、木香主要单体成分脱氢木香内酯 (dehydrocostus lactone, 1)和木香烯内酯(costunolide,2)对人肺腺癌A549细胞分泌VEGF的抑制作用,同时以MTT法测定药物对A549肿瘤细胞生长的抑制作用。结果表明,木香挥发油、土木香挥发油、脱氢木香内酯和木香烯内酯在不影响细胞增殖的浓度范围内,可明显抑制A549细胞分泌VEGF。

VEGF;木香;土木香;脱氢木香内酯;木香烯内酯

血管生成对肿瘤的生长和转移具有重要作用[1]。新生血管的生长和成熟是一个复杂的多因子和多信号传导过程的结果,其中涉及到很多血管生成因子如血管内皮细胞生长因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF)、血管生成素 (angiopoietin)等,以及抑制血管生成的因子如内皮细胞抑制素 (endostatin)、肿瘤抑素 (tumstatin)、可溶性血管内皮细胞生长因子受体 (s VEGFR)等。一般情况下这两类因子处于平衡状态。肿瘤发生时能促进血管生成因子分泌,其中最主要的是 VEGF。大量研究结果表明VEGF在许多癌症组织中过量表达,包括肝癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、乳腺癌等。VEGF及其受体 (vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)在肿瘤的生长和转移中起关键性作用,所以可以通过阻断或干扰VEGF/VEGFR信号传导通路来控制肿瘤生长。近年来以VEGF及其受体作为靶分子的抗肿瘤新药研发取得了很大的进展,已经有数个药物经美国 FDA批准上市。本文以 VEGF的酶联免疫(EL ISA)检测条件优化为基础,研究木香挥发油及主要倍半萜单体化合物的抗肿瘤作用是否与抑制VEGF有关。

木香为菊科多年生草本植物木香Saussurea lappaDecne.的干燥根,别名:云木香、广木香。原产印度,主要分布于我国陕西、甘肃、湖北、湖南、四川、云南、西藏等地,以四川、云南西北部种植较多,产量较大。商品木香目前主要分为三类,即木香、川木香及土木香,其中土木香主要作为木香的代用品使用。传统医学认为,木香具有行气止痛之功效,多用于胃肠气滞所致的脘腹胀痛、呕逆少食或用于湿热痢疾而腹痛,里急后重。现代药理学研究表明:木香还具有改善胃溃疡[2,3]、收缩、炎症[4,5]、肌梗塞及心绞痛[6]等作用,临床上常用于溃疡病、胆绞痛、支气管哮喘等疾病的治疗[7]。木香所含的主要有效成分存在于挥发油中,是以脱氢木香内酯 (dehydrocostus lactone,1)和木香烯内酯 (costunolide,2)为主的多种倍半萜类化合物的混合物。Lee等[8]首次对木香烯内酯的抗肿瘤作用进行了探讨,证明木香烯内酯可通过释放细胞色素 C诱导肿瘤细胞凋亡。作者前期对木香和土木香进行了化学成分研究,通过提取分离结合化学修饰等手段共获得 18种木香倍半萜单体化合物并研究了其体外抗肿瘤活性,结果表明木香挥发油、土木香挥发油、脱氢木香内酯、木香烯内酯对人肺癌A549细胞增殖均表现较好的抑制活性[9],本文拟在对 VEGF酶联免疫检测条件进行优化的基础上,研究以上活性部位及活性单体的抗肿瘤活性是否与VEGF相关。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

美国 Costar及广州洁特 (JET)生物过滤制品有限公司生产的 96孔可拆分高亲和力聚苯乙烯酶标板;CKX31型倒置显微镜 (菲律宾奥林巴斯公司);恒温 CO2培养箱 (美国 Thermo公司);5810 R型台式高速低温离心机 (德国 Eppendorf公司);全自动酶标仪 (美国Biotek集团)。

木香挥发油、土木香挥发油、脱氢木香内酯和木香烯内酯(化学结构式见图 1)以细胞培养级DMSO溶解,并稀释至所需浓度,-20℃冰箱保存备用。人血管内皮生长因子单克隆抗体 (MAB293)、生物素化抗体 (BAF293)、重组人 VEGF 165(293-ve)、Streptavidin-HRP (DY998)、 Substrate Reagent (DY999)购自 R&D公司;RP M I 1640培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素购自 Invitrogen公司;胰酶、MTT、DMSO购自Amresco公司,其余试剂均为国产分析纯。

图 1 脱氢木香内酯和木香烯内酯的化学结构式Fig.1 Chemical structures of dehydrocostus lactone and costunolide

1.2 缓冲液配制

包被液:PBS(磷酸盐缓冲液);封闭液:1% BSA,5%蔗糖,0.05%叠氮钠/PBS;洗涤液:0.05% Tween-20/PBS;酶结合物稀释液:1%BSA/PBS;显色剂:R&D公司 Substrate Reagent(DY999);终止液:1 mol/L硫酸

1.3 细胞培养

人肺腺癌细胞A549为烟台大学分子药理实验室保种。用含 10%胎牛血清的 RPM I 1640培养液(含青霉素 1×105U/L,链霉素 100 mg/L),于 37℃CO2培养箱中常规培养,隔天传代。A549细胞呈贴壁状态生长。

1.4 MTT法测定细胞活性

将细胞密度为 1×105个/mL的单细胞悬液接种于 96孔细胞培养板内,每孔 200μL,于 CO2培养箱中常规培养。24 h后分别加入不同浓度的待测试样品,每个浓度设3个平行孔,同时设DMSO空白孔,培养 48 h后,每孔加入MTT 8μL(终浓度为 200 μg/mL),继续培养 4 h后弃去上清,吸干残留液,每孔加入DMSO 100μL,振摇至生成的蓝紫色结晶完全溶解后,以 630 nm为参比波长,用酶标仪测定570 nm处的吸光值 (A570)。细胞增殖抑制率 (%) =100×(1-实验组 A570/空白对照组 A570)。

1.5 测定蛋白浓度

以不同浓度的牛血清白蛋白(BSA)溶液绘制工作曲线,利用 Bradford法测定细胞培养上清液总蛋白浓度。

1.6 EL ISA检测条件的优化研究

1.6.1 聚苯乙烯酶标板的选择

分别采用 Costar及 JET的 96孔可拆分高亲和力聚苯乙烯酶标板作为固相载体,进行 EL ISA检测并比较结果。

1.6.2 聚苯乙烯酶标板经紫外线辐照处理

聚苯乙烯酶标板置于装有紫外灯 (S W-CJ-1Cu型,苏州净化设备有限公司)的医用净化工作台上,固定紫外灯与酶标板基底的垂直距离为 10 cm,于空气中对酶标板作 30 min辐照处理,完毕后置室温储存备用。

1.6.3 抗体包被时间的改变

用 PBS磷酸盐缓冲液将 hVEGF单克隆抗体稀释至 1μg/mL后,将其置于 4℃中分别包被 24、48、72 h,封闭洗涤甩干后备用。

1.6.4 EL ISA检测方法

经包被、封闭、加样、温育等过程,拍干后加生物素化抗 hVEGF抗体 100μL/孔,37℃温育 60 min,洗板 4次,拍干后加入HRP酶结合物 100μL/孔,37℃温育 30 min,洗板 4次,彻底拍干后加入 T MB显色剂 100μL/孔,37℃温育 30 min,然后加入终止液50μL终止反应,酶标仪 450 nm处测量吸光值。

1.7 数据统计学处理

2 结果

2.1 EL ISA检测条件的优化研究

2.1.1 聚苯乙烯酶标板的选择

分别取 Costar及 JET公司生产的酶标板条,加入抗 hVEGF单克隆抗体在 4℃下包被 24 h,进行EL ISA测定。如图 2所示,Costar及 JET酶标板条对抗 hVEGF单克隆抗体的亲和力无明显差别,由于JET酶标板价格低于 Costar酶标板,因此以后的实验中均选择 JET酶标板以节约实验成本。

图 2 不同厂家酶标板的比较Fig.2 Comparison of EL ISA plates from differentmakers

2.1.2 紫外辐照的影响

如图 3所示,经紫外辐照后 JET酶标板所测得吸光值较辐照前明显提高,表示紫外辐照可提高JET酶标板条对抗 hVEGF单克隆抗体的亲和力。

图 3 紫外辐射对 JET酶标板吸光值的影响Fig.3 Effect ofUV on the absorbency of JET plate

2.1.3 包被时间的影响

如图 4所示,一抗包被 24 h即可达到较理想的效果,延长包被时间至 48 h或 72 h吸光值反而有所降低,因此将一抗包被时间确定为 24 h。

图 4 不同包被时间对吸光值的影响Fig.4 Effect of coating time on the absorbency

2.2 木香挥发油、土木香挥发油及倍半萜单体对VEGF的抑制作用

2.2.1 对A549细胞增殖的影响

按照 1.4节所述MTT方法检测药物对A549细胞增殖的影响,计算细胞增殖抑制率。如表 1所示,木香挥发油在 0.20～3.12μg/mL,土木香挥发油在0.20～12.5μg/mL,脱氢木香内酯和木香烯内酯在0.20～25μg/mL浓度范围内对A549细胞增殖无明显抑制作用。

表 1 药物对A549细胞增殖的影响Table 1 Effects of test drugs on the cell proliferation ofA549

3.12 2.2 10.1 6.5 -7.5 1.56 0.1 -7.2 4.6 -3.6 0.78 2.9 0.2 2.2 0.3 0.39 0.3 1.3 0.3 2.5 0.20 4.3 0.6 1.5 6.1

2.2.2 对A549细胞分泌VEGF的抑制作用

在药物对细胞增殖无明显抑制作用的浓度范围内,以优化后的 EL ISA检测条件测定 VEGF浓度。取 JET酶标板进行紫外辐照 30 min后,每孔加入100μL抗人VEGF单克隆抗体,将其置于 4℃中包被 24 h后,封闭洗涤甩干后,加入样本按照 1.6.4所述方法进行测定,吸光度值和VEGF浓度的标准曲线如图 5所示,根据该标准曲线计算细胞培养上清液样本中VEGF的浓度。

另外以不同浓度的牛血清白蛋白(BSA)溶液绘制工作曲线 (图 6),利用 Bradford法测定细胞培养上清液样本中的总蛋白浓度。

图 5 VEGF浓度和吸光值的标准曲线Fig.5 Working line of the VEGF concentration and absorbance

图 6 BSA蛋白浓度和吸光值的标准曲线Fig.6 Working line of the BS A concentration and absorbance

最后,按照以下公式计算样本单位蛋白中所含的VEGF浓度:单位蛋白中所含的VEGF浓度 (pg/ mg)=VEGF浓度(pg/mL)/总蛋白浓度(mg/mL),实验结果见表 2,组间比较采用 t检验。

表 2 药物对A549细胞分泌VEGF的抑制作用Table 2 Inhibitory effects of test drugs on the release ofVEGF in A549 cells

3 讨论

本实验在测定细胞培养上清液中VEGF浓度的同时,利用Bradford法测定总蛋白含量,计算单位蛋白中VEGF的含量,可校正由于细胞分布不均或细胞死亡导致的测定误差。实验结果表明,木香挥发油和土木香挥发油均可明显抑制 A549细胞分泌VEGF,作用强度相当,可为使用土木香作为木香的临床替代品提供一定的理论依据。脱氢木香内酯和木香烯内酯为木香和土木香药材中的主要化学成分,实验结果表明这两种倍半萜类化合物可明显抑制A549细胞分泌VEGF,提示VEGF可能为木香及其制剂发挥抗肿瘤作用的主要作用靶点之一,木香及其有效成分对于VEGF蛋白表达及基因水平的影响正在进一步研究中。

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9 WangL(王潞),Zhao F(赵烽),He EQ(何恩其),et al. Effects of eighteen sesquiterpenes fromSaussurea lappaon the proliferation of six human cancer cell lines.Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发),2008,20:808-812.

Inhibitory Effects of Sesquiterpenes fromSaussurea lappa on the Vascular Endothelial Growth Factor

HAO Li-jie1,2,ZHAO Feng1＊,GAO Zhi-ting1,XU Hui1,L IU Ke1

1School of Phar m acy,YantaiUniversity,Yantai 264005,China;2Yantai Science&B iotechnology Co.,Ltd.,Yantai 264006,China

In this paper,the EL ISA method to detect human VEGF was studied and optimized.The effectof EL ISA plate materials,coating time of the capture antibody,ultraviolet irradiation were studied,and the optimized detection condition is following:Jet EL ISA plate can be used instead of costar EL ISA plate;24 h is the best for the capture antibody coating time;ultraviolet irradiation increases the reaction to the capture antibody.Petroleum ether fractions ofSaussurea lappaandInula helenium,two main constituents dehydrocostus lactone(1)and costunolide(2)were evaluated for their inhibitory activities on the VEGF realease in human lung cancer cell line A549.The effects of above test samples on the cell proliferation ofA549 were evaluated byMTTmethod.The results indicated that the petroleum ether fractions of S. lappa andI.helenium,dehydrocostus lactone and costunolide significantly inhibited theVEGF release,wherereas the cell proliferation ofA549 cellswas not affected.

VEGF;Saussurea lappa;Inula helenium;dehydrocostus lactone;costunolide

R969.1;Q946.91

A

1001-6880(2010)04-0687-05

2009-05-27 接受日期:2009-09-22

山东省优秀中青年科学家科研奖励基金 (2006BS02005, 2007BS02005)

＊通讯作者 Tel:86-535-6706921;E-mail:zhaofeng74@yahoo.com.cn