远志中远志酸含量影响因素初探

赵云生,万德光,裴 瑾,李占林,田洪岭,任志萍

1成都中医药大学药学院,成都 610075;2山西省农科院经济作物研究所;3山西省汾阳市疾控中心,汾阳 032200

远志中远志酸含量影响因素初探

赵云生1,2,万德光1＊,裴 瑾1,李占林2,田洪岭2,任志萍3

1成都中医药大学药学院,成都 610075;2山西省农科院经济作物研究所;3山西省汾阳市疾控中心,汾阳 032200

采用 HPLC法测定远志药材、根心、远志叶中远志酸含量,考察产地、纬度、海拔、生长期、采收期以及远志不同生长部位对远志酸含量的影响,探讨远志中远志酸含量影响因素。结果表明:产地、采收期以及远志不同生长部位对远志酸含量的影响达极显著水平,纬度与海拔对远志酸含量具有一定影响。远志生产应选择适宜产区,适时采收,远志Polygala tenuifoliaW illd根心与卵叶远志P.sibiricalL.叶中含有一定的远志酸,具有开发价值。

远志;远志酸;影响因素;HPLC

远志始载于《神农本草经》,具有安神益智,祛痰,消肿的作用,是我国传统出口药材,也是国家 42种重点保护的三级野生品种之一,《中国药典》2005年版收载远志基源为远志Polygala tenuifoliaW illd和卵叶远志P.sibiricalL.,以远志酸含量作为远志质量控制的指标[1]。

本实验研究了远志药材 (去心根皮)、根心、远志叶中远志酸含量变化,对远志中远志酸积累影响因素进行了探讨,以期更好地开发和利用我国远志资源,为远志规范化种植及新药源的扩大提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

戴安公司 Summit HPLC,Detector UVD 170U, Column Thermostat TCC-100;浙江大学 N2000色谱数据工作站,索氏提取器。

1.2 试药

对照品:远志酸 (成都中医药大学中药材标准化教育部重点实验室提供)。

样品:远志药材 21份 (野生样品 16份,栽培样品 5份),根心 5份,叶 11份。野生样品均采自2007年 10～11月,分布于向阳的山中坡地或平原深沟坡地,伴生植物低矮,大多不高于 40 cm,与远志杂生,土层深厚,砂质或略黏壤土。栽培远志种植于山西省农科院经作所试验田。

所有样品由成都中医药大学万德光教授鉴定为远志Polygala tenuifoliaWilld和卵叶远志P.sibiricalL。

2 试验方法

2.1 色谱条件

采用 18烷基硅烷键合硅胶色谱柱 Welchrom C18(5μm,250 mm×4.6 mm);流动相甲醇-0.2%磷酸溶液 (70∶30);检测波长 210 nm;理论塔板系数以远志酸计 7190;流速:lmL/min;柱温 30℃;进样量:远志药材 5μL、根心或叶 20μL。标准品及样品色谱图见图 1。

图 1 远志标准品(上)与样品(下)色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of standard(above)and sample (low)

2.2 供试品溶液的制备

取 60℃下干燥至恒重的远志粉末 (4号筛)约1 g,精密称定,置索氏提取器中,加甲醇 100 mL,回流 5 h,减压回收甲醇至干,残渣加 10%稀盐酸 20 mL,沸水浴回流 2 h,冷却,过滤并用蒸馏水洗涤沉淀至中性,用甲醇溶解沉淀并定容至 10 mL,即得供试品溶液[2,3]。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取远志酸对照品 3.74 mg,置 10 mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,即得 (每 1 mL含远志酸 374μg)。

2.4 标准曲线的绘制

分别精密吸取对照品溶液(0.374 mg/mL)1、2、4、6、8、10、15、20、25、30μL进样,按上述色谱条件测定,以对照品质量 (X)为横坐标,峰面积积分值(Y)为纵坐标,绘制标准曲线,经回归处理,得回归方程:Y=3.8663X-0.3909,r=0.9999,远志酸在0.374～11.22μg与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验

精密吸取同一远志供试品溶液,按上述色谱条件连续进样 6次,每次 5μL,测定峰面积,RSD= 0.38%,表明精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一远志药材供试液,室温放置,在上述色谱条件下,分别在 0、3、6、9、12、24 h进样 1次,每次 5 μL,测定峰面积,计算远志酸含量,共考察24 h,RSD =0.31%,表明样品溶液在至少 24 h内稳定。

2.7 重现性试验

精密称取同一样品 6份,分别按供试品溶液制备方法制得供试品溶液,按上述色谱条件测定远志酸含量,RSD=2.87%,表明该方法重现性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的远志药材粉末各 0.5 g,共6份,按供试品溶液制备方法制得供试液,精密加入远志酸对照品溶液(浓度为 0.374 mg/mL)1 mL,按上述色谱条件测定远志酸含量,计算回收率,结果远志酸平均回收率为 98.45%,RSD=2.80%(表 1)。

表 1 回收率试验(n=6)Table 1 Recovery test(n=6)

2.9 样品测定

分别取制备好的样品溶液,按上述色谱条件,进样,测定,记录远志酸峰面积,计算远志酸含量。

3 远志中远志酸含量影响因素探析

采用 Excel计算各样品远志酸含量,采用SPSS13.0进行 F测验,比较各样品间远志酸含量差异,试验结果见表 2～4。

3.1 产地对远志酸含量的影响

对山西、陕西、甘肃、四川四省 16份药材远志酸含量测定结果表明 (表 2),不同产地远志酸含量差异达极显著水平 (P=0.01,n=3),产地对远志次生代谢产物远志酸含量影响显著。

3.2 纬度与海拔对远志酸含量的影响

海拔高度(422～2309 m)与纬度 (31°41′～39° 31′)对远志酸含量具有一定影响 (图 2)。海拔高度在 422～698 m时远志酸含量较高,均大于 1%,其余海拔高度远志酸含量一般不大于 1%。纬度对远志酸积累的影响呈波浪形变化,纬度 34°09′～35° 52′、37°15′～39°31′,随着纬度的增高,远志酸含量呈下降趋势,在纬度 35°52′～36°50′,远志酸含量呈上升趋势,总体上来说远志酸含量在纬度 34°09′～35°20′区间含量较高,大于 1%,该纬度区间山西闻喜、陕西西安等地也是远志主产区,可能与这些地区夏季高温干燥的气候环境有利于远志有效物质群的积累有关,可以选择这一区域建立远志 GAP生产基地,远志酸含量在其余纬度区间一般不高于 1%。

远志酸是远志皂苷的水解产物,不同海拔地区远志酸含量存在一定差异,变化幅度 0.45%～1.59%,平均含量 0.86%。海拔高度在 422～698 m的地区远志酸含量明显高于其余海拔地区,随着海拔升高,远志酸含量呈现一定的下降趋势。

远志酸的积累通常是在一定的海拔高度与纬度下共同作用的结果,将二者结合起来分析,能够进一步接近远志酸积累的实际状况,为此将远志分布的纬度与海拔高度分别进行加权换算,以最高纬度39°31′与最高海拔高度 2309 m的加权数均为 1,通过下式进行换算:某远志加权数 =该远志纬度/39° 55′+该远志海拔高度 /2309

以远志加权数为横坐标,远志酸含量为纵坐标,绘制散点图 (图 2),纬度与海拔加权数大于 1.05时,随着加权数的增加,远志酸含量具有逐渐降低的趋势,纬度与海拔加权数在 1.05～1.20、1.42时远志酸含量均较高,大于 1%。

3.3 生长期与采收月份对远志酸含量变化的影响

该试验以栽培远志“汾远 1号”为试验材料,在大田栽培条件下进行试验,方差分析表明,不同生长时间与采收月份,远志酸含量达极显著差异 (P= 0.01,n=3),7月份采收远志的远志酸含量极显著高于其它月份采收的远志,由表 3可知,远志在 7、8、9月份采收,远志酸含量均显著高于 10、11月份采收的远志,在 10月份与 11月份采收远志,远志酸含量相差不显著 (P=0.05,n=3)。

由远志不同生长时间可知,生长 2个月远志与生长 8个月远志远志酸含量差异不显著,说明远志酸积累与远志生长时间可能关系不大,而与远志收获时期关系密切,由于“汾远 1号”为系选材料,亲缘关系一致,生长于同一块试验田中,远志生长环境比较一致,因而远志酸含量差异只能由两个因素造成,一为远志生长发育阶段,二为远志采收时期,本实验结果表明,远志酸生物积累可能与远志收获时期有关,而与远志生长发育阶段关系并不密切。7月份采收远志酸含量较高,说明生产地在 6～7月份的高温干燥环境能够刺激远志酸生物合成的各种关键酶,从而提高远志酸的生物积累,同一份试验材料在 7月份采收时远志酸含量显著高于 10月份远志,说明外界环境条件改变时,已经合成的远志酸能够自行分解,可见在进行远志规模化生产时,选择适宜的采收时期比生长时期更为重要,采收期对远志药材质量影响较大。

表 3 不同生长期与采收时间药材(去心)与根心远志酸含量(n=3)Table 3 Content of polygalacic acid in different vegetative period and harvest time(n=3)

3.4 远志根心中远志酸含量变化

远志根心中含有一定量的远志酸 (表 3),以 7、10两个月份采收的远志根心,远志酸含量较高,其余月份相差不大,远志根心中远志酸积累模式与远志药材(远志根皮)有所区别,远志根心在 8～10月份远志酸含量逐渐增加,与远志药材中远志酸积累模式正好相反,远志根心与远志药材远志酸积累模式是否具有相关性,有待进一步研究。远志根心与远志药材在 7月份采收时远志酸含量均较高,说明产区 6～7月份的生态因子有利于远志酸生物合成。

3.5 远志叶中远志酸含量变化

对不同产地远志叶中远志酸含量测定表明 (表4),不同产地远志 (Polygala tenuifoliaW illd)叶中远志酸含量均非常低,几乎不含有远志酸,但四川荗县与九龙山卵叶远志叶 (P.sibiricalL.)中远志酸含量较高,达 0.4%以上,具有一定的开发价值。远志与卵叶远志叶中远志酸含量差异说明二者种间的遗传差异影响到了叶中化学成分的生物合成。

表 4 远志叶中远志酸含量(n=3)Table 4 Content of polygalacic acid in leaves of P.tenuifolia orP.sibiricain different habitats(n=3)

4 讨论与小结

4.1 远志酸含量积累受产地影响显著,生产中对远志产区的强调十分必要。远志酸积累受采收期影响较大,生长期对远志酸积累影响可能并不大。

4.2 远志不同生长部位对远志酸含量影响极大,远志药材(去心)远志酸含量远大于远志根心与远志叶,远志酸能在远志根心中产生一定积累,在进行远志提取物生产时,可以将远志根心作为原料使用。远志 (Polygala tenuifoliaW illd)叶中远志酸积累非常少,但卵叶远志叶 (P.sibiricalL.)中远志酸含量稍高。

4.3 海拔高度与纬度对远志酸含量积累的影响主要是通过影响温度与光照实现,由于远志酸积累是一个复杂的生物学过程,受多种因素影响,除海拔与纬度外,还受产区海陆位置、地形、季风、土壤以及远志遗传特征等等因素的影响,因而进行远志生产应多种因素综合考虑。

4.4 远志根心与远志药材在 8～10月份远志酸积累趋势相反,二者有无相关性,有待进一步研究。

1 China Phar macopoeia.First Part(中国药典,一部),2005. 107-108.

2 Liu YP(刘友平),Wan DG(万德光),Song Y(宋英).Determination of dehydroxypresenegenin inPolygalae teuuifoliaby HPLC.Chin Tradit Herb D rugs(中草药),2001,32:786-787.

3 Liu YP(刘友平),Wan DG(万德光),Liu T(刘涛),et al. The contentof total saponinsofPolygalae teuuifoliafrom different habitats was determined by spectrophotometry.J Chengdu Univ TCM(成都中医药大学学报),2000,23(2): 46-47.

Study on Some Influence Factors of Polygalacic Acid Content inPolygala tenuifoliaW illd orP.sibiricalL.

ZHAO Yun-sheng1,2,WAN De-guang1＊,PEIJin1,L I Zhan-lin2,T IAN Hong-ling2

1College of Phar macy,Chengdu University of Traditional ChineseM edicine,Chengdu 610075,China;2Industrial Crop Research Institute,Shanxi Academy of Agricultural Sciences;3Fenyang Centers forD isease Prevention&Control,Fenyang 032200,China

The polygalacic acid was deter mined to study its influence factors in medicinalmaterials,root xylem and leaves ofPolygala tenuifoliaW illd orP.sibiricalL.by HPLC,and the factorswere investigated about the growing area,latitude,elevation,the period of growth or harvesting and the different parts ofPolygala tenuifoliaW illd orP.sibiricalL.. The results showed that the difference of growing area,harvesting period and the different parts ofPolygala tenuifoliaW illd orP.sibiricalL.is significant at the 0.01 level,latitude and elevation has some impact.The geo-authentic producing areas should be chosen in Radix Polygalae production,and it should be harvested timely.The root xylem ofPolygala tenuifoliaW illd and the leaves ofP.sibiricalL.have some polygalacic acid and development value.

Polygala tenuifoliaW illd;P.sibiricalL.;polygalacic acid;influence factors;HPLC

R917;Q946.91

A

1001-6880(2010)04-0634-05

2008-09-16 接受日期:2009-02-09

山西省科技攻关项目(2006031080-1);山西省自然科学基金项目(2007011091)

＊通讯作者 Tel:86-28-87779801;E-mail:wdg@cdutcm.edu.cn