望江南总蒽醌苷抗肿瘤作用的研究

李月玲,张太平,彭士明,张鹤云

南京大学生命科学学院医药生物技术国家重点实验室,南京 210093

望江南总蒽醌苷抗肿瘤作用的研究

李月玲,张太平,彭士明,张鹤云＊

南京大学生命科学学院医药生物技术国家重点实验室,南京 210093

探讨望江南总蒽醌苷(CSAG)的抗肿瘤作用及其作用机制。利用MTT法检测望江南总蒽醌苷对肝癌细胞 HepS、肺癌细胞(A549)、小鼠肉瘤(S180)腹水型肿瘤细胞等肿瘤细胞和人正常肝细胞 L-02增殖的影响;实体瘤称重法测定 CSAG对肝癌(HepS)实体瘤的抑制情况,将接种肿瘤的小鼠分成 5组,每组 6只小鼠,雌雄各半,给药 12 d,停药后 24 h处死动物,秤鼠体重,剥离出肿瘤,秤瘤重,测定生化指标。结果显示,CSAG对以上肿瘤细胞的增殖均有抑制作用,对肝癌细胞荷瘤小鼠肿瘤生长具有明显的抑制作用;同时可增加胸腺指数和脾指数。因此,CSAG具有明显的抗肿瘤效果,其抗肿瘤作用可能与提高机体免疫力和诱导细胞凋亡有关。

望江南总蒽醌苷;抗肿瘤;肝癌细胞 HepS;免疫;细胞凋亡

望江南 (Cassia occidentalisL.),豆科,决明属,又名羊角豆、野扁豆,主要分布于长江以南各地,望江南的种子、根、茎、叶都可入药,是民间一种常用的中药,在临床上也有应用。望江南的主要活性成分为蒽醌苷类化合物,由蒽醌类衍生物与糖结合而成,具有抗菌消炎、泻下、抗风湿等作用。尽管望江南民间应用疗效确切[1],国内外学者对其药理活性和化学成分也进行了初步研究,但是目前仍然很难依据现有研究资料对其进行合理开发和利用。从国内外的文献报道来看,目前对望江南的药理活性研究主要限于其抗炎作用。本实验对望江南总蒽醌苷体内外抗肿瘤作用进行了研究,以期为开发传统中药提供科学依据,使望江南得到更有效的利用。

1 材料

1.1 实验动物及瘤株

昆明种小白鼠,雌雄各半,18～22 g,购于南京医科大学动物饲养中心,清洁级。肝癌 HepS细胞株由中科院上海药物研究所提供,江苏省肿瘤研究所培养传代。肺癌细胞(A549)、小鼠肉瘤(S180)腹水型肿瘤细胞、人正常肝细胞 (L-02)本实验室冻存。

1.2 主要试剂及仪器

望江南总蒽醌苷样品 (自制,纯度为 95.3%); RPM I-1640细胞培养液 (G IBCO公司,批号: 2535081);四噻唑氮蓝MTT(南京大治生物科技有限公司,批号:0793);环磷酰胺 (江苏恒瑞制药,批号:07122821);胎牛血清 (北京元亨圣马生物技术研究所,批号:XA070621HY);DG5033A酶联免疫检测仪(南京华东电子集团医疗装备有限公司生产); CO2培养箱 (Thermo Forma公司);DY-1001S型DNA电泳仪 (南京大学仪器厂);JD801凝胶电泳图象分析仪(南京捷达公司)。

2 方法

2.1 望江南总蒽醌苷的制备

望江南干燥茎(本实验室种植)粉碎机粉碎,加10～15倍体积冷水,煮沸 20 min,过滤取上清,滤渣加水再重复煮两次,收集三次滤液,此即为提取母液[2]。母液经大孔树脂层析,酒精洗脱,浓缩除去酒精,离心得清液即为望江南总蒽醌苷样品[3]。

2.2 细胞体外增殖分析

2.2.1 望江南总蒽醌苷对肝癌细胞(HepS)体外增殖的抑制作用

无菌条件下取接种 7～10 d的 HepS瘤源小鼠的腹水,无血清 RP M I-1640培养基洗涤两次,用含10%小牛血清的 RPM I-1640培养基配制成细胞浓度为 1×106/mL的细胞悬液,向 96孔板每孔加入80μL,设一空白对照孔不加细胞悬液。每个试验组设 3～5个复孔 (蒽醌苷的终浓度分别为:1.5625、3.1250、6.25、9.375、12.5、15.625、18.75、21.875、25μg/mL),另设无药物的阴性对照组,再设一孔为各浓度样品的无细胞组。培养板置于 37℃5%的CO2培养箱中培养 24 h,加入 5 mg/mL的MTT8.5 μL/孔,继续培养 4 h,加入 20%的 SDS 40μL/孔,次日于酶标仪上,490 nm下测OD值。做三次重复,每组的复孔取均值,并计算细胞生长抑制率。

细胞生长抑制率 =[1-(试验组 -无细胞组)/阴性对照组]×100%

2.2.2 望江南总蒽醌苷对肺癌细胞(A549)体外增殖的抑制作用

取对数生长期的细胞株配制成细胞浓度为 1× 105/mL的细胞悬液,加入到 96孔板中,每孔 80μL,设一空白对照孔不加细胞悬液。试验组加不同浓度的蒽醌苷 80μL,每个试验组设 3～5个复孔[4],根据预试验设置试验组蒽醌苷的终浓度分别为:6.25、9.375、12.5、15.625、18.75、21.875、25μg/mL。另设无药物的阴性对照组,再设一孔为各样品浓度的无细胞组。以下操作同 2.2.1.

2.2.3 望江南总蒽醌苷对小鼠肉瘤 (S180)腹水型肿瘤细胞的体外增殖的抑制作用

小鼠肉瘤 S180腹水型肿瘤细胞株经小鼠腹腔传代,无菌抽取腹水瘤细胞,置于含 15%灭活胎牛血清的DMEM培养基中,37℃5%CO2培养箱中进行培养,当细胞生长至对数期时,配制成浓度为 5× 105/mL细胞悬液,接种于两块 96孔培养板上,每孔80μL设一空白对照孔不加细胞悬液,试验组加不同浓度的望江南总蒽醌苷 80μL,每个试验组设 6个复孔。试验组望江南总蒽醌苷的终浓度分别为: 6.25、9.375、12.5μg/mL,另设无药物的阴性对照组,再设一孔为各样品浓度的无细胞组。一块板培养 24 h和另一块培养 48 h,以下操作同 2.2.1。

2.2.4 望江南总蒽醌苷对人正常肝细胞 (L-02)体外增殖的抑制作用

复苏冻存的L-02细胞后,以含 10%小牛血清的 RPM I-1640培养基培养传代,取第三代对数生长期的细胞,配制成细胞浓度为 1×105/mL的细胞悬液,接种于 96孔板上,以下操作同 2.2.1。

2.3 望江南总蒽醌苷体内抗肿瘤作用

HepS细胞株小鼠腹腔内传代,5～7 d传代一次,传代三次后,无菌条件下抽取腹水,加无菌生理盐水洗涤离心,800 r/min离心 5 min,如此洗涤 3次,调整细胞浓度至 1×107/mL,台盼蓝染色法检测存活率≥95%,用无菌注射器抽取细胞悬液皮下注射于小鼠左后肢腋下,每只鼠接种 0.2 mL。接种 24 h后将试验动物随机分成五组,分别为模型组,阳性对照组及高、中、低三个剂量给药组。每组六只,雌雄各半。模型组腹腔注射生理盐水,阳性对照组腹腔注射环磷酰胺,剂量为 20 mg/kg·d,给药组腹腔注射的剂量分别为 0.4、0.2、0.1 mg/kg·d,每天注射前称体重;连续注射 12 d[6]。于末次注射后 1 h,称鼠体重,颈椎脱臼处死小鼠。完整剥离瘤块,称重;解剖小鼠,取出脾脏和胸腺,称重。计算抑瘤率、胸腺指数和脾指数。

公式:抑瘤率 (%)=(模型组平均瘤重 -给药组平均瘤重)/模型组平均瘤重 ×100

胸腺指数脾指数 =脾脏重量/小鼠体重(mg/g)

胸腺指数 =胸腺重量/小鼠体重(mg/g)

2.4 DNA凝胶电泳法测定望江南总蒽醌苷对肝癌细胞 HepS凋亡的影响

取 HepS肝癌肿瘤小鼠腹腔液,加入含 10%小牛血清的 RPM I-1640培养基,配制成细胞悬液,取悬液加入 24孔板中,0.5 mL/孔,并分成五组:空白对照组、CSAG-20μg/mL组、CSAG-30μg/mL组、CSAG-40μg/mL组、CSAG-50μg/mL组。分别加入0.5 mL RPM I1640、CSAG-20μg/mL、CSAG-30μg/ mL、CSAG-40μg/mL、CSAG-50μg/mL置于 37℃, 5%CO2培养箱中培养 48 h,取处于对数生长期的细胞 1.5 mL,1500 r/min离心 4 min,弃上清,加入 1 mL PBS缓冲液悬浮细胞,1500 r/min离心 4 min,弃上清,加入 40μL 5 mol/L的 KI,振荡 30 s,加 100 μL生理盐水混匀,加苯酚/氯仿/异戊醇 (25∶24∶1)和苯酚/氯仿(1∶1)各抽提一次,所加的量与管中液体体积相同。小心地吸取上层水相至新管,加 0.1倍体积 3 mol/L醋酸钠和 2.5倍体积的无水冷乙醇,上下倒置混匀,置于-20℃沉淀 0.5 h;取出于 4℃13000 r/min条件下离心 10 min,将沉淀溶于 TE缓冲液中,取各组DNA溶液 16μL,分别与 4μL上样缓冲液混匀后电泳[7]。

3 结果与分析

3.1 望江南总蒽醌苷的体外抗肿瘤活性

望江南总蒽醌苷对体外培养的 HepS、A549、S180细胞的增殖均有显著的抑制作用 (表 1～3);在总蒽醌浓度 ＜9.3750μg/mL时,促进人正常细胞的增殖,浓度≥9.3750μg/mL时,抑制人正常细胞的增殖,江南总蒽醌苷达到一定浓度后对细胞产生毒性(表 4)。

表 1 望江南总蒽醌苷对鼠肝癌 HepS细胞增殖的影响(x±s,n=12)Table 1 Effect of total anthraquinone glycosides from Coffee Senna on mouse hepatoma cell HepS proliferation(±s,n=12)

表 1 望江南总蒽醌苷对鼠肝癌 HepS细胞增殖的影响(x±s,n=12)Table 1 Effect of total anthraquinone glycosides from Coffee Senna on mouse hepatoma cell HepS proliferation(±s,n=12)

注:与对照组性比:1P＜0.001。Note:vs control group:1P＜0.001.

组别Group药物浓度Drug concentration (μg/mL)平均A值Average A抑制率Inhibition ratio(%)对照组 Control group 0.79±0.0781试验组 Experimental group 1.5625 0.08±0.012190.00 3.1250 0.07±0.023191.25 6.2500 0.03±0.000196.20 9.3750 0.06±0.015192.50 12.5000 0.05±0.021193.75 15.6250 0.05±0.038193.75 18.7500 0.04±0.025195.00 21.8750 0.04±0.038195.00 25.0000 0.00±0.0001100.00

表 2 望江南总蒽醌苷对人肺癌A549细胞增殖的影响(x±s,n=12)Table 2 Effect of total anthraquinone glycosides from Coffee Senna on proliferation of human lung cancer cells A549(±s,n=12)

表 2 望江南总蒽醌苷对人肺癌A549细胞增殖的影响(x±s,n=12)Table 2 Effect of total anthraquinone glycosides from Coffee Senna on proliferation of human lung cancer cells A549(±s,n=12)

注:与对照组性比:1P＜0.001。Note:vs control group:1P＜0.001.

组别Group药物浓度Drug concentration (μg/mL)平均A值Average A抑制率Inhibition ratio(%)对照组 Control group 0.84±0.103试验组 Experimental group 6.2500 0.50±0.0501 41.18 9.3750 0.23±0.0051 72.94 12.5000 0.03±0.0201 96.47 15.6250 0.02±0.0251 97.65 18.7500 0.01±0.0201 98.82 21.8750 0.00±0.0001 100.00 25.0000 0.00±0.0001 100.00

表 3 望江南总蒽醌苷对小鼠肉瘤 S180腹水型肿瘤细胞增殖的影响 (±s,n=12)Table 3 Effect of total anthraquinone glycosides from Coffee Senna on proliferation of S180 mouse sarcoma asides tumor cells(±s,n=12)

表 3 望江南总蒽醌苷对小鼠肉瘤 S180腹水型肿瘤细胞增殖的影响 (±s,n=12)Table 3 Effect of total anthraquinone glycosides from Coffee Senna on proliferation of S180 mouse sarcoma asides tumor cells(±s,n=12)

注:与对照组性比:1P＜0.05,2P＜0.005。Note:vs control group:1P＜0.05,2P＜0.005.

组别Group药物浓度Drug concentration (μg/mL)平均A值Average A抑制率Inhibition ratio(%)对照组Ⅰ(24 h) 1.20±0.113试验组Ⅰ(24 h) 6.2500 1.03±0.127 14.16 9.3750 0.29±0.028275.83 12.5000 0.04±0.023196.67对照组Ⅱ(48h) 0.84±0.047试验组Ⅱ(48h) 6.2500 0.93±0.000 7.14 9.3750 0.07±0.000291.67 12.5000 0.06±0.017294.64

表 4 望江南总蒽醌苷对人正常肝细胞 L-02细胞增殖的影响(±s,n=12)Table 4 Effect of total anthraquinone glycosides from Coffee Senna on human normal liver cell L-02 proliferation (±s,n=12)

表 4 望江南总蒽醌苷对人正常肝细胞 L-02细胞增殖的影响(±s,n=12)Table 4 Effect of total anthraquinone glycosides from Coffee Senna on human normal liver cell L-02 proliferation (±s,n=12)

组别Group药物浓度Drug concentration (μg/mL)平均A值Average A抑制率Inhibition ratio(%)对照组 Control group 0.98±0.053试验组 Experimental group 1.5625 1.23±0.0001-25.51 3.1250 1.29±0.0001-31.63

注:与对照组性比:1P＜0.001。Note:vs control group:1P＜0. 001.

3.2 望江南总蒽醌苷对 HepS实体瘤生长的抑制作用

实验结果表明,望江南总蒽醌苷对实体瘤小鼠的瘤重有抑制作用 (表 5),能提高脾指数和胸腺指数(表 6),抑制肿瘤生长的同时可以保护小鼠的免疫器官,与模型组相比差异有显著性。

表 5 望江南总蒽醌苷对荷瘤小鼠瘤重的影响 (±s,n= 12)Table 5 Effect of total anthraquinone glycosides from Coffee Senna on tumorweight of tumor-bearingmice(±s,n=12)

表 5 望江南总蒽醌苷对荷瘤小鼠瘤重的影响 (±s,n= 12)Table 5 Effect of total anthraquinone glycosides from Coffee Senna on tumorweight of tumor-bearingmice(±s,n=12)

注:与模型组相比:1P＜0.001,2P＜0.005。Note:vsmodle group:1P＜0.001,2P＜0.005。

表 6 望江南总蒽醌苷对荷瘤小鼠脾指数和胸腺指数的影响(±s,n=12)Table 6 Effect of total anthraquinone glycosides from Coffee Senna on spleen index and thymus index of tumorbearingmice(±s,n=12)

表 6 望江南总蒽醌苷对荷瘤小鼠脾指数和胸腺指数的影响(±s,n=12)Table 6 Effect of total anthraquinone glycosides from Coffee Senna on spleen index and thymus index of tumorbearingmice(±s,n=12)

注:与阳性对照组相比:1P＜0.05,2P＜0.005。Note:vs positive group:1P＜0.05,2P＜0.005.

组别Group剂量Dose (mg/kg·d)脾指数Spleen index (mg/g)胸腺指数Thymus index (mg/g)模型组 6.56±0.295 2.85±0.307 CTX组 20 4.87±0.083 1.50±0.143高剂量组 0.4 7.28±0.34721.75±0.1141中剂量 0.2 7.07±0.58222.18±0.0602低剂量组 0.1 7.17±0.71722.28±0.3922

3.3 DNA凝胶电泳法测定 CSAG对 HepS肝癌细胞凋亡的影响

实验结果表明(图 1),25μg/mL没有小分子量的DAN片段,大部分细胞直接坏死;其他四组与空白对照组相比,有较多的小分子 DNA条带且形成“Ladder”,大分子量 DNA量较少,说明细胞内的大部分DNA已降解成分子量为核小体整数倍的DNA梯形片段,而对照组为连续性DNA碎片。结果表明四个低剂量的望江南总蒽醌苷对 HepS的凋亡有显著的促进作用。

图1 DNA凝胶电泳图Fig.1 Map ofDNA agarose gel electrophoresis

4 讨论

体外实验表明,望江南总蒽醌苷对HepS、A549、S180的增殖具有显著的抑制作用;体内抑瘤实验表明,望江南总蒽醌苷对小鼠 HepS肝癌有明显的抑制作用,且能抑制肿瘤生长,提高脾脏指数和胸腺指数,增强免疫功能,其增强免疫功能是望江南抗肿瘤的机制之一。DNA凝胶电泳法和结果说明,望江南总蒽醌苷抑制 HepS细胞增殖的机制可能是,在低浓度时引起细胞凋亡,高浓度时细胞毒作用直接毒杀细胞。

以上实验说明望江南总蒽醌苷在体内外均具有显著的抗肿瘤活性,其可能机制为提高免疫力和诱导细胞凋亡。本实验只是一个初步研究,需进一步探明望江南总蒽醌苷抗肿瘤的作用靶点,为合理开发利用望江南提供依据。

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Study on Anti-tumor Effects of Total Anthraquinone Glycosides from Coffee Senna

L I Yue-ling,ZHANG Tai-ping,PENG Shi-ming,ZHANG He-yun＊
State Key Laboratory of Phar m aceutical B iotechnology,School of Life Sciences,Nanjing University,Nanjing 210093,China

To study anti-tumor effect of anthraquinone glycosides from the tuber of Coffee Senna(CSAG)and itsmechanis m of action.The effects of CSAG on proliferation of human lung cancer cellsA549,S180 mouse sarcoma ascites tumor cells,mouse hepatoma cells HepS and human normal liver cellsL-02 was detected byMTT colorimetric assay;HepS solid tumormouse modelwasmade by subcutaneous injection of logarithmic phase of HepS cells.After medications for 12 days,the effect of CSAG at different dose(0.4,0.2,0.1 mg/kg·d)on inhibition rate of tumorweight,thymus index and spleen indexwas detected.The result is thatCSAG can inhibit the proliferation of these tumor cells,and also can significantly inhibited the growth of the tumorof tumor-bearingmice,increase thymus index and spleen index at the same time. So CSAG have significantly anti-tumor effects.The mechanis m of anti-tumor effects of CSAGmight be related to the increased immunity function ofmice and induced apoptosis.

total anthraquinone glycosides from Coffee Senna;HepS;anti-tumor;immunity;apoptposis

R285;Q946.91

A

1001-6880(2010)04-0701-05

2009-06-29 接受日期:2009-10-23

＊通讯作者 Tel:86-25-83592335;E-mail:cflab@126.com