绞股蓝多糖提取分离、化学结构及生物活性的研究进展

尚晓娅,钦传光,曹 刚,徐春兰,牛卫宁

西北工业大学生命科学院,西安 710072

绞股蓝多糖提取分离、化学结构及生物活性的研究进展

尚晓娅,钦传光＊,曹 刚,徐春兰,牛卫宁

西北工业大学生命科学院,西安 710072

绞股蓝是我国特色天然资源,近年来研究发现多糖是其重要的药用活性成分,具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、降血糖、抗疲劳等生物活性。更重要的是绞股蓝多糖不仅具有显著的抗肿瘤活性,还参与和介导了免疫功能的调节,能够提高机体免疫功能而对正常细胞没有毒副作用,在恶性肿瘤、艾滋病等威胁人类健康疾病的防治和治疗方面具有广阔的应用前景,有希望开发成我国特色的创新药物。本文对绞股蓝多糖分离纯化、结构以及生物活性等方面进行详细综述,为以后进一步研究提供理论参考。

绞股蓝多糖;分离纯化;结构;生物活性

绞股蓝 (Gynostemm a pentaphyllumMakino)为葫芦科绞股蓝属多年生草质藤本植物,具有增强免疫、抗肿瘤、降血压、降血脂、抗氧化等作用,且安全无毒[1-3]。1986年,国家科委在“星火计划”中,把绞股蓝列为待开发的“名贵中药材”首位。2002年 3月 5日,国家卫生部将其正式列为新资源药食同源保健品。目前,全世界已知绞股蓝植物有 13种,我国占 11种,其中 7种为我国独有,占全部种数的53.8%。绞股蓝主要分布在亚洲一些国家,在我国应属陕西绞股蓝资源最为丰富,主要分布在以秦巴山区为中心的 37个县市,安康、平利等县市目前已成为我国绞股蓝最大的生产基地,所产绞股蓝品种最为优良。近年研究发现绞股蓝多糖是绞股蓝的有效活性成分之一,具有增强免疫、抗肿瘤、抗氧化、降血糖、抗疲劳、保护肝损伤、保护神经细胞谷氨酸氧化性损伤等生物活性。本文就绞股蓝多糖的分离纯化、结构、生物活性以及现阶段的开发利用及研究展望等几个方面进行详细阐述,旨在为绞股蓝多糖的深入研究和开发利用提供参考。

1 绞股蓝多糖的制备与纯化

1.1 绞股蓝多糖的提取

目前绞股蓝多糖的提取方法主要为水提取和碱提取,后来又有研究者尝试了微波辅助提取工艺,具体工艺提取条件见表 1。目前大多采用热水提取法提取绞股蓝多糖,热水浸提的温度一般为 80～100℃,浸提时间一般 1～2 h,浸提次数 1～3次。将浸提得到的多糖溶液过滤,滤液浓缩至一定体积后,利用多糖溶于水而不溶于醇的特点,将多糖用乙醇沉淀出来,沉淀分别用 95%乙醇、丙酮、乙醚洗涤,干燥得粗多糖。确定提取条件时,一般采用单因素法通过正交实验设计对提取工艺条件进行优化。

此外,微波辅助提取绞股蓝多糖也是一种行之有效的提取方法。池爱平等[8]在此工艺条件下,多糖提取率为 3.37%。较热水浸提法相比,绞股蓝水溶性多糖提取率增加 0.55%。可见微波辅助提取能缩短提取时间,提高绞股蓝多糖提取率。与热水浸提法相比较,微波辅助提取技术的最大优点是提高提取率、节省时间,同时它还具有成本低、投资少的优点,在工业化提取植物有效成分方面具有广阔的应用前景。

表 1 绞股蓝多糖工艺提取条件Table 1 Extraction of polysaccharides fromGynostemm a pentaphyllumMakino

1.2 绞股蓝多糖的分离纯化

目前比较详细的绞股蓝多糖分离纯化工艺有两种[9,10]:

绞股蓝→95%乙醇回流 (50℃,6 h)→蒸馏水提取 (95℃,1.5 h)→过滤、浓缩、透析→4倍乙醇沉淀→洗涤沉淀,减压干燥→粗多糖→8%水溶液→DEAE-Sepharose CL-6B柱层析→Sephadex G-100柱层析→均一的 3个多糖组分。

粗多糖→无水 CaCl2除果胶→H2O2脱色→3倍乙醇沉淀→洗涤沉淀,干燥→精制绞股蓝多糖→0.5%水溶液→0.45μm滤膜过滤→Q Sepharose Fast Flow柱层析→Sephadex G-200柱层析→Sephadex G-25柱脱盐→冷冻干燥→均一多糖 GPS-2和GPS-3。

绞股蓝多糖除了用凝胶过滤色谱 Sephades G-200、Sephadex G-100等柱纯化外,也用醋酸纤维素膜电泳(硼酸氢钠缓冲液,pH 10)鉴定其纯度,用甲苯胺蓝在 40 v检测 50 min。

水提醇沉获得的多糖常含有较多的游离蛋白和植物色素,为了使多糖精品具有较好的色泽和较高的给药安全性,应经过脱色和去蛋白的步骤对多糖进行精制。目前对绞股蓝多糖的研究普遍没有建立较完善的分离纯化路线,难以得到均一的多糖组分。我们实验室在经过一系列的探讨研究后,建立了适合秦巴绞股蓝多糖分离纯化的工艺路线,采用木瓜蛋白酶 +Sevag法除蛋白,并采用 H2O2法进行脱色,在本工艺路线中,我们在加入 Sevag试剂之前先进行脱色处理,得到了很好的效果。

2 化学结构

关于绞股蓝多糖的化学结构目前研究较多的是单糖组成,但是结果各异,可能与产品的品种、研究手段等因素有关。Wang等[9]对绞股蓝粗多糖(G M)进行分离纯化后得到三个多糖组分:G MA、G MB、G MC,用 GC分析其单糖组成;宋淑亮等[10]从绞股蓝中分离纯化得到两个均一多糖 GPS-2和GPS-3,对 GPS-3的单糖组成进行了分析;Yang等[11,12]分别用 HPLC和毛细管区带电泳分析绞股蓝多糖的单糖组成,其结果见表 2。

结构方面目前仅有 Chi等[13]初步分析了绞股蓝多糖抗疲劳活性主要组分 GPP1-a的一级结构,结构分析表明 GPP1-a是一种由葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖 (1:0.72:0.18)组成的杂多糖,由 (1→4)连接的α-D-葡萄糖残基构成主链,分支位于O-6位置上,支链主要是(1→6)连接的α-D-葡萄糖、(1→3)连接的β-D-半乳糖和 (1→6)连接的α-D半乳糖残基,末端为β-D-半乳糖残基和β-L-阿拉伯糖残基,其结构见图 1。

表 2 绞股蓝多糖的单糖组成Table 2 Monosaccharide composition of polysaccharides fromGynostemm a pentaphyllumMakino

图 1 GPP1-a的结构Fig.1 Structure of Gpp1-a

由上述研究可以推导绞股蓝多糖的主要单糖组成可能为葡萄糖和半乳糖,可能还含有阿拉伯糖、甘露糖、木糖、鼠李糖等单糖成分,其多糖主链可能主要由葡萄糖残基构成。从文献报道可以看出,目前对绞股蓝多糖结构的研究报道较少,仍处于起步阶段,其确切的化学结构还需要大量深入的研究和分析。

3 生理活性和作用机制

3.1 免疫调节

免疫调节是植物多糖最重要和最主要的生物活性,研究发现绞股蓝多糖具有细胞免疫、体液免疫和非特异性免疫功能。唐晓玲等[14]研究发现绞股蓝多糖能显著地增强环磷酞胺处理小鼠淋巴细胞的转化增殖,说明绞股蓝多糖对免疫受抑小鼠的细胞免疫功能具有显著的促进作用。进一步研究发现绞股蓝多糖能显著增强肝癌 Heps小鼠NK细胞活性,同时对淋巴细胞转化能力有所提高,说明其具有细胞免疫促进作用;绞股蓝多糖能够提高小鼠血清溶血素含量,说明其具有体液免疫促进作用;此外,绞股蓝多糖还可以明显提高小鼠碳粒廓清速率和 S180小鼠脾指数,说明绞股蓝多糖能够提高非特异性免疫功能[15]。

剧烈运动会降低机体免疫能力,表现在免疫细胞数量减少,淋巴细胞转换能力降低,细胞免疫功能降低;延迟性过敏反应降低;主要免疫球蛋白 IgA、IgG以及重要补体 C3和 C4含量显著降低;NK细胞的毒性降低,丝裂原诱发的淋巴细胞增殖作用 (衡量 T细胞功能)降低。研究发现服用绞股蓝多糖对疲劳运动小鼠的免疫器官脾脏功能有增强作用,对小鼠特异性免疫能力有提高作用,高剂量下对于ConA诱导小鼠淋巴细胞转化能力有提高作用[16]。因此绞股蓝多糖还能够有效促进疲劳运动小鼠的免疫调节作用。

最近的一项研究表明绞股蓝多糖是一种潜在的免疫调节剂,可以显著促进腹膜巨噬细胞产生 NO, ROS和 TNF-α,并呈剂量依赖性。同时发现绞股蓝多糖抑制人结肠癌 HT-29和 S W-1116肿瘤细胞增殖,对其没有直接的细胞毒性,由此推导绞股蓝多糖抗肿瘤作用机理之一是通过增强机体的免疫功能,诱导细胞因子的表达,达到抗肿瘤的目的[12]。根据以上研究可以推导绞股蓝多糖有可能与其它中药多糖一样,主要通过增强机体的免疫功能来达到杀伤肿瘤细胞的目的,即抗癌作用经过宿主中介作用,增强机体的非特异性和特异性免疫,而非直接杀伤肿瘤细胞。

3.2 抗肿瘤

大量研究发现多糖抗肿瘤作用体现在两个方面,一是对肿瘤细胞的直接抑制;二是提高宿主免疫功能,发挥抗肿瘤作用[17]。最早研究者发现经口服绞股蓝粗多糖,荷瘤小鼠平均存活时间较对照组长,生命延长率高于 50%,初步表明绞股蓝多糖具有较明显的抗癌活性[17]。后来又有研究者对绞股蓝多糖的抗肿瘤活性进行分析,发现绞股蓝多糖不仅对肿瘤细胞有显著的抑制作用,而且对机体的免疫机能有一定的增强作用。

用绞股蓝多糖 (GPS)对荷瘤小鼠灌胃后,测得对 S180肉瘤的抑制率为 31%;GPS用于体外培养的人食管癌细胞 ECa-109,抑制率高达 100%[18]。可见绞股蓝多糖对肿瘤细胞有较强的抑制和杀伤作用,可以直接抑制肿瘤细胞的生长。

绞股蓝多糖对小白鼠移植性肿瘤 S180有显著的抑制作用,与化疗药物 5-Fu合并使用能减轻化疗药物引起的骨髓抑制等不良反应,保护细胞免受自由基的攻击,对机体的免疫机能有一定的增强作用[19]。可见绞股蓝多糖不仅具有显著的抗肿瘤作用,而且能提高荷瘤鼠机体的免疫机能。

综合前面免疫调节活性和上述抗肿瘤活性方面的研究结果,可以看出绞股蓝多糖究竟是如何发挥抗肿瘤作用的?是直接杀伤肿瘤细胞,还是通过增强机体的免疫功能达到杀伤肿瘤细胞的目的?目前此问题仍不清楚,有待进一步探讨和研究。

3.3 抗氧化

研究发现绞股蓝多糖是一种潜在的抗氧化剂,不同的组分之间抗氧化活性存在差异。Wang等[9]研究了绞股蓝粗多糖 (G M)以及其三个均一组分G MA、G MB、G MC的抗氧化活性,并与Vc进行比较,结果表明 G M、G MB和 G MC比Vc具有更强的清除超氧自由基的能力,清除率分别为 93.3%、49.5%和57.9%;G M、G MA、G MB和 G MC均具有很强的清除羟自由基的能力,其中 G M、G MA和 G MB清除率分别为 57.0%、43.8Z%和 25.6%,比 Vc(20%)要高;G MA和 G MB对邻苯三酚自氧化没有抑制作用, G MC的抑制作用比 G M要显著。可见组分 G MC在清除超氧自由基、羟自由基和邻苯三酚方面均具有很强的抑制能力,是一种潜在的抗氧化剂。

娄振岭等[20]研究发现绞股蓝多糖底剂量组能降低正常小鼠脂质过氧化 (LPO)水平,提高正常小鼠超氧化物歧化酶 (SOD)活性;高剂量组能显著降低亚急性衰老模型小鼠脂质过氧化水平,显著提高亚急性衰老模型小鼠超氧化物歧化酶活性。可见绞股蓝多糖的抗氧化活性呈剂量依赖性。

3.4 降血糖

淀粉酶抑制剂可抑制消化道,尤其是十二指肠的淀粉酶活性,因而减少或延缓消化道淀粉水解为单糖,使单糖的吸收减少而降低血糖,所以对糖尿病病人餐后高血糖以及过食碳水化合物引起的脂肪增加有对抗作用。研究发现绞股蓝多糖 (GP)在体外对α-淀粉酶具有较强的抑制作用,且呈剂量依赖性,其抑制率相当于同等浓度阿卡波糖抑制作用的50%左右。同时通过研究 GP对四氧嘧啶高血糖大鼠降血糖作用,发现 GP可降低四氧嘧啶大鼠的血糖及改善糖耐量,而不会导致低血糖,表明绞股蓝多糖具有稳定的降血糖活性。其降血糖机制可能与其刺激胰岛素的释放或促使急性胰岛炎恢复,抑制α-淀粉酶,延缓碳水化合物在小肠的吸收有关[21]。

3.5 抗疲劳

运动时自由基产生增多,被认为是引起运动性疲劳的重要原因之一。通过测定组织中MDA的浓度可以反映机体自由基生成的情况,而通过测定SOD、GSH-Px、CAT的活性可反映机体内自由基清除的情况。疲劳运动小鼠补充绞股蓝多糖后运动能力提高,其原因可能是因为绞股蓝多糖能明显提高小鼠的组织抗氧化能力,能有效地清除运动过程中产生的自由基,防止脂质过氧化反应,保护组织细胞膜的完整性,从而保证运动过程中的氧化供能[22]。

Chi等[13]研究发现绞股蓝均一多糖组分 GPP1-a能够延长小鼠力竭运动的时间,可能是因为 GPP1-a可以清除力竭运动中产生的活性氧族 (ROS)。另外,研究发现 GPP1-a可以显著增加骨骼肌和肝脏中糖原的水平,诱导 GPP1-a增加力竭运动时间,因为骨骼肌和肝脏中糖原的水平可以增强实验动物的运动能力。然而 GPP1-a提高糖原水平的机理仍需要深入研究。

3.6 抗肝损伤

酒精性肝损伤是典型的肝损伤模型,酒精在进入机体之后,在乙醇脱氢酶催化下,可被脱氢氧化为乙醛和乙酸盐,使三羧酸循环障碍和脂肪酸氧化减弱,从而影响脂肪代谢;同时酒精还能导致细胞基因组DNA断裂,抑制DNA修复酶的功能,引发细胞凋亡等作用。宋淑亮等[23]通过研究绞股蓝多糖对HepG2细胞酒精性损伤的保护作用,发现不同浓度的绞股蓝多糖均可以提高损伤后 HepG2细胞的存活率,抑制 AST、ALT水平的升高,减少MDA的形成,提高 SOD的活性,减少细胞凋亡。

CCl4可以诱导 HepG2细胞出现典型的细胞凋亡,研究发现绞股蓝多糖(PGP)对 CCl4导致的肝细胞损伤具有显著的保护作用。MTT检测显示 PGP保护组细胞活性明显高于损伤组;流式细胞仪测定细胞调亡率显示 PGP保护组 (终浓度为 100μg/ mL)凋亡率明显低于 CCl4损伤组,细胞周期各期细胞分布比例无明显变化[24]。

除此之外,绞股蓝多糖对 CCl4造成的小鼠急性肝损伤具有明显保护作用,绞股蓝多糖各剂量组能明显抑制肝损伤小鼠ALT、AST活性的升高;抑制肝组织中MDA含量的升高,提高肝组织中 GSH活性;减轻 CCl4对肝脏细胞的病理损伤[25]。可能是因为绞股蓝多糖具有抗脂质过氧化作用,能直接捕捉、清除自由基,减轻自由基对脂膜及线粒体膜的攻击,稳定膜结构,从而起到保护肝脏的作用,其具体的作用机制还有待进一步研究。

3.7 抗神经细胞损伤

谷氨酸是中枢神经系统含量最高的一种神经递质,急性细胞损伤,如缺糖缺氧、创伤、缺血、昏厥等,会造成谷氨酸的大量释放,从而对神经元造成损伤。在许多神经元退行性疾病中,如帕金森病、阿尔茨海默病和肌萎缩性(脊髓)侧索硬化等,谷氨酸也发挥着极其重要的作用。研究者在细胞水平研究绞股蓝多糖对神经细胞谷氨酸氧化性损伤的保护作用,发现不同浓度绞股蓝多糖试验组神经细胞损伤有不同程度的减轻,与谷氨酸损伤组相比有显著性差异,表明绞股蓝多糖对神经细胞谷氨酸氧化性损伤有明显的保护作用。因此绞股蓝多糖可以潜在地用于神经退行性疾病方面的治疗,但是目前其神经细胞损伤保护作用的机制尚不明确,有待进一步研究[26]。

4 结语

绞股蓝是我国的特色资源,多糖是绞股蓝的重要药理活性成分,但是目前国内外对绞股蓝多糖的研究起步较晚,在多糖的提取、制备,分离纯化,活性成份的筛选,结构研究以及药理作用机理等方面的研究水平远远落后于其它植物多糖。目前国内外对绞股蓝多糖的研究还存在以下有待深入研究的重要问题:

(1)目前对绞股蓝多糖的研究大都停留在粗多糖的阶段,较少得到均一的多糖组分,进一步进行生物活性方面研究时缺乏说服力。

(2)目前的研究主要集中在生物活性方面,但是此方面的研究不系统,缺乏深度,其作用机理尚不清楚。

(3)除此之外,绞股蓝多糖的均一组分和化学结构尚不明确,目前尚未阐明绞股蓝多糖的结构与生物活性之间的关系,限制了绞股蓝多糖药物的研究和开发。

就目前的研究工作来讲,绞股蓝多糖方面的研究主要集中在国内,国外在此方面的研究尚未见文献报道,可能主要因为资源所限。现已研究报道绞股蓝多糖的药理作用主要集中在免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、降血糖、抗疲劳、抗肝损伤这六个方面,特别是免疫调节和抗肿瘤作用比较明显,值得深入研究,有望开发成新的抗肿瘤药物和免疫调节剂。国内对绞股蓝多糖的研究处于优势,我们应该充分利用我们的资源优势,研制具有我国特色的创新药物。

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Advances in Research on the Polysaccharide from Gynostemm a pentaphyllumMakino

SHANG Xiao-ya,Q IN Chuan-guang＊,CAO Gang,XU Chun-lan,N IU Wei-ning
Faculty of L ife Science,Northwestern Polytechnical University,Xi’an 710072,China

Gynostemm a pentaphyllumMakino is the natural resource with Chinese characteristics.The polysaccharide is one of the importantmedicine ingredientsofGynostemm a pentaphyllumMakino,which has the phar macological actions as the anti-tumor,immunomodulatory,antioxidation,anti-fatigue activity,decrease of blood glucose,and so on.Especially,Gynostemm a pentaphyllumMakino polysaccharide has not only the significant anti-tumor activity,but also joins in adjusting immune function,which can improve the immune function of organism but has no toxic side effect on normal cells. It hopes to be the original new drugwith Chinese characteristics.Therefore,its application haswide prospect.This article summarizes detailedly research developments on its separation,and purification,identification,structural analysis,biological activities and research progress.

polysaccharide fromGynostemm a pentaphyllumMakino;isolation and purification;structure;bioactivity

Q946.91;R284;O629

A

1001-6880(2010)03-0514-06

2009-04-07 接受日期:2009-06-16

国家自然科学基金 (NSFC 20802057);中国博士后科学基金 (20080441194)

＊通讯作者 Tel:86-29-88491840;E-mail:loya721521@126.com