7S伴大豆球蛋白及其糖基化产物对大豆11S球蛋白热聚集的影响

孙炜炜，于淑娟*

(华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510640)

7S伴大豆球蛋白及其糖基化产物对大豆11S球蛋白热聚集的影响

孙炜炜，于淑娟*

(华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510640)

研究7S伴大豆球蛋白(β-伴大豆球蛋白)及其糖基化产物对大豆11S球蛋白热聚集的影响。从浊度、ξ-电位、粒度、SDS-PAGE测定得出在30mmol/L Tris-HCl缓冲溶液中(含β-巯基乙醇)，7S球蛋白及其糖基化产物能够抑制11S球蛋白的热聚集，并且糖基化产物的抑制效果比未糖基化的7S球蛋白明显；7S球蛋白及其糖基化产物抑制11S球蛋白热聚集的机理不同，7S球蛋白糖基化产物对11S球蛋白热聚集的抑制不是由于电荷的作用。

7S伴大豆球蛋白；大豆11S球蛋白；糖基化；热聚集

Abstract ：The effects of β-conglycinin and glycated β-conglycinin on the thermal aggregation of glycinin was studied. Evidence was presented to suggest that β-conglycinin and glycated β-conglycinin could both prevent thermal aggregation of glycinin in 30 mmol/L Tris-HCl buffer solution (β-Me exsisted). Further, addition of glycatedβ-conglycinin prevented thermal aggregation of glycinin more obviously than β-conglycinin. The results also indicated that the inhibitory mechanism of glycated βconglycinin on glycinin aggregation was not as same as that of β-conglycinin due to charge-charge interactions.

Key words：β-conglycinin；glycinin；glycosylation；thermal aggregation

热处理是大豆加工过程中常用的方法之一，大豆蛋白在热诱导过程中会不可避免的产生宏观聚集体[1]。7S伴大豆球蛋白(β-伴大豆球蛋白)和大豆11S球蛋白是大豆蛋白的主要储藏蛋白，分别占大豆蛋白总含量的37%和31%[2]。大豆11S球蛋白在有还原剂的溶液中会产生明显的热聚集现象，添加 7S伴大豆球蛋白可以通过电荷的作用抑制11S球蛋白的热聚集[3]。

食品中蛋白质的糖基化是指通过蛋白质的ε-氨基基团与多糖的还原性羰基末端反应得到共价复合物[4]。糖基化产物对于环境条件具有较高的适应性，与以次级力结合的蛋白质-多糖体系相比，其结合不受热或pH值的影响[5]。糖基化对蛋白质的表面荷电量、热稳定性、表面疏水性等均有影响，而这些性质往往是影响蛋白质热聚集的重要因素[6-7]。由于接入糖链的不同，糖基化对蛋白质热聚集的影响并非完全一样[8]。对7S球蛋白抑制11S球蛋白热聚集的性质，许多学者已经做过研究，但尚未见学者研究过糖基化的7S球蛋白对11S球蛋白热聚集的影响。

本实验主要从浊度、ξ-电位、粒度、SDS-PAGE电泳方面研究7S球蛋白及其不同分子质量的糖基化产物(G67、G150、G500)在有还原剂存在的Tris-HCl缓冲溶液中对11S球蛋白热聚集的抑制作用，为进一步开展通过糖基化抑制大豆蛋白热聚集的研究提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

低温脱脂豆粕(氮可溶性指数＞80) 山东新嘉华公司；葡聚糖(67、150、500kD) Sigma公司。

所有化学试剂均为分析纯；实验用水为去离子水。

1.2 仪器与设备

CR22GⅡ高速冷冻离心机 Hitachi Koki 公司；UV-2300分光光度计 上海天美科学仪器有限公司；ECP3000 SDS-PAGE三恒电泳仪 北京市六一仪器厂；DNP-9082电热恒温培养箱 上海精宏试验设备有限公司；NaNo-Zs马尔文纳米粒度分布仪 英国Marlvern公司。

1.3 方法

1.3.1 7S球蛋白和11S球蛋白的分离纯化

7S球蛋白依照Nagano等[9]的方法制备，制备流程如下：

1.3.2 7S球蛋白糖基化产物的制备

将7S蛋白粉与葡聚糖以质量比1:1混合后，用水溶解调至6g/100mL后冷冻干燥。干燥后的粉状物过120目筛后放置于干燥器内于60℃条件下干热反应，保持相对湿度79%，并在容器底部放置饱和的KBr溶液，反应一周后即得糖基化产物[10]。7S球蛋白与分子质量为67、150、500kD的葡聚糖反应的糖基化产物分别记为G67、G150、G500。

1.3.3 热聚集实验

不同pH值的热聚集实验：11S球蛋白分别与等量的7S球蛋白及其糖基化产物(以7S球蛋白计)混合均匀后溶于不同pH值的30mmol/L Tris-HCl缓冲溶液中(含10 mmol/L β-巯基乙醇)于80℃水浴30min[11]，冷却至室温测定浊度和ξ-电位。

不同离子强度的热聚集实验：11S球蛋白分别与等量的7S球蛋白及其糖基化产物(以7S球蛋白计)混合均匀后溶于不同离子强度(以NaCl 调节)Tris-HCl缓冲溶液中(pH8)，于80℃水浴保温30min，冷却至室温测定浊度和ξ-电位。

1.3.4 浊度测定

根据Damodaran等[3]的方法，分别取1.3.3节热聚集实验中的样品液于波长540nm处测定浊度。

1.3.5 ξ-电位测定

采用马尔文纳米粒度分布仪测定添加7S球蛋白及其糖基化产物的11S球蛋白溶液热聚集后的ξ-电位。波长和散射角度分别固定在632nm和90°，操作温度为室温(25℃)。

1.3.6 粒度测定

采用马尔文纳米粒度分布仪测定添加7S球蛋白及其糖基化产物的11S球蛋白溶液热聚集前后的粒径分布。波长和散射角度分别固定在632nm和90°，操作温度为室温(25℃)。

1.3.7 SDS-PAGE电泳

按照Laemmli[11]的方法在不连续的缓冲体系中进行，使用12%分离胶和4%浓缩胶。样品以相同比例溶于还原性的缓冲液(10% SDS，2.5%β-巯基乙醇)中，然后在沸水中加热5min，于6000×g离心3min，以一定比例上样。电泳过程恒流，浓缩胶电流40mA，分离胶电流调至80mA，溴酚蓝前沿至封口胶时关闭电源。电泳结束后将凝胶进行考马斯亮蓝染色40min，使用脱色液(甲醇、冰乙酸、水体积比为1:1:8)脱色至透明，于凝胶成像系统进行成像处理。

2 结果与分析

2.1 浊度测定

图1 不同pH值缓冲溶液中7S球蛋白及其糖基化产物对11S球蛋白热聚集的影响Fig.1 Effects of β -conglycinin and glygatedβ - conglycinin on the thermal aggregation of glycinin under different pH conditions

由图1可见，在还原剂存在下，11S球蛋白的宏观聚集主要是由碱性亚基发生聚集[4]。各组分的浊度都是随着pH值的增大，先升高后降低，在pH4.8附近浊度最大，偏酸或偏碱均不利于热聚集。加入7S球蛋白及其糖基化产物后的11S球蛋白溶液的浊度低于11S，且加入7S球蛋白的浊度高于加入其糖基化产物。相比较而言，G500的浊度低于G67和G150(二者浊度曲线相近)。此结果表明7S球蛋白具有抑制11S球蛋白热聚集的性质，由于大分子糖链的接入，导致7S球蛋白空间位阻增大，使得热聚集程度变得更小，难以形成可溶性的宏观聚集体，溶液浊度降低。接入到7S球蛋白肽链上的葡聚糖分子质量越大，空间位阻越大，因此G500比其他两种糖基化产物的浊度低。这说明糖基化有利于增强7S球蛋白对11S球蛋白热聚集的抑制作用。

图2 不同离子强度(NaCl)的缓冲溶液中7S球蛋白及其糖基化产物对11S球蛋白热聚集的影响Fig.2 Effects of β -conglycinin and glygatedβ - conglycinin on the thermal aggregation of glycinin under different ionic strength conditions

由图2可知，11S球蛋白溶液浊度随着NaCl离子强度的增加而降低，盐离子浓度的增加有利于抑制11S球蛋白热聚集[4]，其余组分浊度受离子强度影响不是很大。加入7S球蛋白及其糖基化产物溶液的浊度低于11S球蛋白溶液，并且加入7S球蛋白的浊度高于加入其糖基化产物浊度，3种糖基化产物的浊度曲线相近。此结果表明，7S球蛋白及其糖基化产物能够抑制11S球蛋白的热聚集，但离子强度不是影响其抑制效果的主要因素，糖基化产物的抑制效果比7S球蛋白好，其原因与2.1节中的原因相似。这同样说明糖基化有利于增强7S球蛋白对11S球蛋白热聚集的抑制作用。

2.2 ξ-电位测定

表1 不同pH值溶液中添加7S球蛋白及其糖基化产物的11S球蛋白溶液加热后ξ-电位的变化Table 1 Changes in z-potential of glycinin in the presence of βconglycinin or its glycated counter part under different pH conditions after heating at 80 ℃ for 30 min

表2 不同离子强度溶液中添加7S球蛋白及其糖基化产物的11S球蛋白溶液加热后ξ-电位的变化Table 2 Changes in z-potential of glycinin in the presence of β-conglycinin or its glycated counter part under different ionic strength conditions after heating at 80 ℃ for 30 min

从表1、2可以看出，加入7S球蛋白的11S球蛋白溶液的ξ-电位比未加入7S球蛋白的偏低，7S球蛋白对11S球蛋白热聚集的抑制作用主要是由于电荷的作用[3]，7S球蛋白的加入增加了体系中的负电荷量，ξ-电位的绝对值越大，说明溶液体系越稳定[12]。加入7S球蛋白糖基化产物的11S球蛋白溶液的ξ-电位绝对值始终低于加入11S球蛋白溶液的ξ-电位，然而由2.1节得出的结论是加入7S球蛋白糖基化产物的溶液体系比加入7S球蛋白的溶液稳定。这说明电荷不是决定其体系稳定性的主要因素，可能是由于接入长的糖链，使得体系空间位阻增大而抑制了11S球蛋白的热聚集；中性葡聚糖的接入屏蔽掉了7S球蛋白表面的部分电荷，使得其ξ-电位升高，表面疏水性降低。7S球蛋白糖基化产物抑制11S球蛋白热聚集的机理与7S球蛋白的抑制聚集机理存在一定差异。

2.3 粒度测定

图3 添加7S及其糖基化产物的11S溶液加热后的粒度变化Fig.3 Changes in particle size of soybean glycinin solution in the presence of β-conglycinin or its glycated counter part after heating 30 min

由图3可见，11S球蛋白溶液加热后，粒径明显增加至1000nm左右，加入7S球蛋白及其糖基化产物的11S球蛋白溶液加热前的粒径和未加入的相差不大，但加热后的粒径仅增大至60nm左右，并且加入7S球蛋白糖基化产物的粒径略小于加入7S球蛋白，这说明加入7S球蛋白抑制了11S球蛋白的热聚集，糖链的接入进一步抑制了体系中宏观聚集体的生成，这也印证了2.1节浊度测定的结果。

2.4 SDS-PAGE电泳

取pH8、离子强度为0mmol/L(NaCl)的Tris-HCl缓冲溶液溶解大豆球蛋白[13]，各溶液加热前、后上清液和沉淀的SDS-PAGE图谱见图3。

图4 加热前、后大豆球蛋白溶液的电泳图谱Fig.4 SDS-PAGE of soybean glycinin solution before and after thermal treatment at 80 ℃ for 30 min

图3显示，11S球蛋白溶液加热后，上清液中的碱性亚基消失而出现在沉淀的图谱中，11S球蛋白加热后产生的宏观聚集体主要由11S球蛋白的碱性亚基组成[14]。碱性亚基并未出现在加热后的沉淀中，7S球蛋白抑制了11S球蛋白碱性亚基的聚集，这与资料报道一致[15]。条带3、8、13显示了G67和7S球蛋白一样能够抑制11S的热聚集。同样，其他条带显示了G150和G500对11S的热聚集也具有抑制作用。

3 结 论

7S球蛋白及其糖基化产物都具有抑制11S球蛋白热聚集的性质，并且糖基化产物的抑制效果优于未糖基化的7S球蛋白；二者抑制11S球蛋白热聚集的机理不同，糖基化的7S球蛋白对11S球蛋白热聚集的抑制机理还有待于进一步研究。7S球蛋白糖基化可以作为一种抑制大豆蛋白热聚集的新方法，对于我国丰富的大豆资源来说，无疑是一种很好的拓宽其应用范围的途径。

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Effects ofβ-Conglycinin and Glycatedβ-Conglycinin on the Thermal Aggregation of Glycinin

SUN Wei-wei，YU Shu-juan*
(College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

TS214.2

A

1002-6630(2010)15-0159-04

2010-03-23

国家自然科学基金项目(20776050)；广东省自然科学基金项目(7006508)

孙炜炜(1988—)，男，硕士研究生，主要从事大豆蛋白与多糖的糖基化反应研究。E-mail：sunweiwei409@yahoo.com.cn

*通信作者：于淑娟(1955—)，女，教授，博士，主要从事制糖工程、碳水化合物分子修饰研究。E-mail：lfshjyu@scut.edu.cn