死后大鼠脾脏组织FTIR测量结果的法医学分析

黄 平，余荣军，李 立，柯 咏，樊拴良，王振原

（1.司法部司法鉴定科学技术研究所 上海市法医学重点实验室，上海200063；2.西安交通大学 医学院 法医学系，陕西 西安710061；3.宁波市公安局 刑侦支队，浙江 宁波315040；4.复旦大学 上海医学院 法医学系，上海200032）

死后大鼠脾脏组织FTIR测量结果的法医学分析

黄 平1，2，余荣军3，李 立1，4，柯 咏2，樊拴良2，王振原2

（1.司法部司法鉴定科学技术研究所 上海市法医学重点实验室，上海200063；2.西安交通大学 医学院 法医学系，陕西 西安710061；3.宁波市公安局 刑侦支队，浙江 宁波315040；4.复旦大学 上海医学院 法医学系，上海200032）

目的 应用傅里叶变换红外（FTIR）光谱技术分析大鼠死后脾脏组织随死亡时间增加的化学变化过程，为死亡时间推断研究提供新的途径与研究数据。方法 大鼠断颈处死后，在30℃、20℃及4℃环境中，不同死亡时间点提取大鼠脾脏组织，并运用FTIR光谱仪测定不同化学基团随死亡时间的变化。结果 随着死亡时间的推移，大鼠脾脏组织FTIR光谱的主要吸收峰峰位没有明显变化，而其吸收峰强度有明显差异：（1）1 080 cm-1和1 238 cm-1被指认核酸谱带吸收峰的峰强呈下降趋势；（2）1 541 cm-1被指认酰胺Ⅱ吸收峰的峰强呈上升变化；（3）1 396cm-1被指认脂肪酸吸收峰的峰强呈上升变化；（4）指认为C-H结构振动的2 852、2 871、2 923、2 958cm-1吸收峰的峰强呈现上升趋势。结论 FTIR光谱分析技术有望成为法医死亡时间推断的有效方法。

傅立叶变换；红外光谱；死亡时间；脾脏

Abstract：ObjectiveTo explore chemical changes in the rat spleen postmortem using FTIR spectroscopy and to provide a new method and research data for estimation of postmortem interval.MethodsRats were sacrificed by cervical dislocation and the cadavers were kept at 30℃，22℃-26℃ and 4℃ in a controlled environment chamber.The spleens were sub-samples at different postmortem time points.All spleen tissues were measured using FTIR spectrometer.ResultsThe absorption peak position showed no changes after death，but absorption intensity displayed obvious changes： （1）the absorption intensity assigned to nucleic acid （1080 cm-1and 1238 cm-1） showed decreasing tendency；（2）the absorption intensity assigned to amide Ⅱ（1541 cm-1）showed increasing tendency；（3）the absorption intensity assigned to fatty acid （1396 cm-1） increased.（4）the absorption intensity assigned to C-H vibration （2852，2871，2923，2958cm-1） showed increasing tendency.ConclusionFTIR spectroscopy can be an effective method for the estimation of postmortem interval.

Key words：Fourier transform；infrared spectrometry；postmortem interval；spleen

死亡时间的推断一直是法医学研究的重点和难点之一。死亡时间的确定有利于死亡方式或死亡性质的判断，可为破案提供线索，缩小侦查范围。目前国内外法医学者运用多种技术手段推断死亡时间，但精确的推断死亡时间仍没有得到解决[1-4]。傅里叶变换红外光谱 （FTIR）能准确灵敏地对细胞内物质相应基团的分子振动变化进行检测，且特异性高、操作简便。构成组织和细胞的基本物质是蛋白质、糖、脂肪、核酸等，因此细胞和组织红外光谱是这几类生物分子相互叠加的结果，红外光谱可精确反映出其含量和构型的变化。生物体死亡后由于细胞内各类水解酶及腐败菌的化学作用，生物分子含量、结构及其化学基团均会发生变化[5-9]。本研究以死后大鼠脾脏组织为样本，运用FTIR光谱衰减全反射技术进行动态监测，分析其随死亡时间的推移所呈现出的变化规律，从而为推断死亡时间提供一种新的研究方法，并对现有的推断方法进行补充。

1 材料与方法

1.1 实验动物分解及取材

健康雄性SD大鼠30只（西安交通大学医学院实验动物中心提供），体重240～260g。购回后于温度20℃，湿度40%～60%，环境中饲养2d。脱颈椎法快速处死大鼠。分别放置于4℃、20℃、30℃的环境中。每个温度组10只SD大鼠。放置于4℃、20℃分别于大鼠死后 0、6、12、24、48、72、96、120、144、168h 对脾脏进行单个大鼠的多次重复取材，每次取材位置相延续。放置于 30℃大鼠在死后 0、6、12、24、36、48、60、72h 取材，单只大鼠多次取材（高温自溶液化，有形固体组织可取材到72h）。每个死后时间点取材10mg，蒸馏水和PBS洗净组织表面血迹，存放于2.5ml冻存管内，立即投入液氮中保存。

1.2 光谱学测量

用乙醚擦洗ZnSe晶体，背景扫描。岛津IR Solution软件，设置红外测量参数，分辨率为4cm-1，波数范围400～4 000cm-1，扫描次数100次；光谱显示吸光度模式。液氮中取出组织放置于ATR探头ZnSn晶体表面，下压ATR探头上的杠杆挤压晶体表面组织，挤压后组织与晶体紧密相贴。电吹风调至冷风挡位，冷风吹挤压组织5min。FTIR光谱图谱基线校正，400～4 000cm-1中所有基线处吸光度保持为0。光谱平滑设置为10。归一化处理光谱图，在1 647cm-1处进行归一化。大鼠脾脏FTIR光谱见图1。

图1 大鼠脾脏FTIR光谱

1.3 数据处理与分析

SPSS 13.0统计学软件计算不同死亡时间点吸收峰峰高比，用平均值和标准差表示，六种数学方程模型选择，对吸收峰强比和死亡时间曲线拟合：线形模型、四次方模型、三次方模型、复合模型、生长模型、指数模型对死后峰强比变化进行数学方程模拟，P＜0.05被认为有统计学意义。

2 结果

2.1 20℃大鼠死后脾脏光谱学变化

大鼠脾脏 3 012、2 958、2 925、2 871、2 852、1 541、1 396 cm-1吸收峰峰强死后明显升高，1 238、1 153、1 080 cm-1吸收峰峰强死后显著下降。3 303、1 652、1 456、1 338、1 313、1 170 cm-1吸收峰峰强保持稳定。选取吸收峰峰强上升和下降变化在死后24 h内不明显。2 958、2 925、2 871、2 852 cm-1吸收峰峰强在死后72 h要高于3 303 cm-1吸收峰峰强。1 652 cm-1、1 541 cm-1吸收峰死后出现小吸收峰，小吸收峰数目随死亡时间延长而增加。1 541吸收峰峰强在72 h后高于1 652 cm-1吸收峰峰强，且1 541 cm-1吸收峰峰面积和峰宽死后有增加趋势（见图2）。A3012/A3303、A2958/A3303、A2925/A3303、A2871/A3303、A2852/A3303显示出相似变化趋势，死后24 h没有显著变化，各相邻死亡时间点之间没有统计学差异。死后24 h迅速上升至96 h后下降，此后再上升至 168 h。 A1652/A1541、A1456/A1396、A1652/A1396、A1541/A1396死后下降，A1456/A1396下降趋势较其它三个峰强比值低。A1652/A1396、A1541/A1396死后24 h内迅速下降，各相邻死亡时间点有统计学差异。A1238/A1396、A1080/A1396死后24 h又迅速下降持续到72 h后保持稳定到96 h，此后继续下降到120 h，144 h～168 h再次保持稳定（见图3）。三次方曲线拟和在6种拟和曲线中显示出最高拟和决定系数，A1652/A1396显示出最高的决定系数，R2=0.926（见图 4）。

图2 大鼠死后脾脏不同时间点FTIR光谱

图3 大鼠脾脏峰强比变化趋势

图4 大鼠脾脏峰强比的拟合曲线

2.2 4℃、30℃大鼠死后光谱学变化

环境温度4℃，大鼠死后ATR FTIR光谱变化与20℃相比没有显著变化，产生变化吸收峰1 396 cm-1在光谱中增加，并与20℃变化趋势保持一致。3 012、2 958、 2 925、 2 871、2 852、1 541、1 396 cm-1吸收峰峰强死后明显升高。脾脏2 958、2 925、2 871、2 852 cm-1吸收峰峰强死后24 h高过3 303 cm-1。脾脏1 541 cm-1吸收峰峰强在死后24 h高于1 652 cm-1吸收峰。3 303、1 652、1 338、1 313 cm-1吸收峰峰强保持稳定。死后72 h 1 541 cm-1吸收峰出现小吸收峰。1 652 cm-1吸收峰峰面积显著下降，1 238、1 080 cm-1吸收峰峰强死后显著下降。1 238、1 080 cm-1在死后60 h保持稳定（见图 5）。

3 讨论

3.1 2 800～4 000cm-1波数范围光谱学变化

C-H伸缩振动引起了3 030～2 800 cm-1波数区域3 012、2 958、2 925、2 852 cm-14个吸收峰均来自脂类的振动，其中3 012 cm-1为烯烃族的H-C=CH伸缩振动，来自于脂肪和胆固醇酯，可以作为检测不饱和酰基测量指标[10-11]。在大鼠ATR FTIR光谱中这些吸收峰死后增加。脂肪分子增加，大鼠死后和人离体所有组织能量代谢停止，甘油三酯酶和脂肪酸乙酰化酶将停止作用，这样组织中原有的脂肪无法分解成甘油和脂肪酸，脂肪酸没有乙酰化也无法进行β氧化，使得体内原有脂肪和脂肪酸含量保持不变。死后细菌在20～28℃有最佳的繁殖速度，而细菌繁殖速度是以指数形式生长，细菌会利用死后组织中的化学物质来合成自身繁殖所需要的蛋白质、膜脂、碳水化合物和核酸。脂肪是细胞膜、细菌细胞壁合成所必须的化学物质，死后随着细菌大量繁殖，脂肪含量也在迅速提高。3 012、2 958、2 925、2 852 cm-1四个吸收峰代表饱和和不饱和脂肪含量变化，它们死后增加可能证明我们的假设的正确性。但仍需要进一步实验研究证明细菌繁殖导致脂肪含量增加这一假说的正确性。

图5 4℃、20℃、30℃ 大鼠死后72 h光谱

3.2 1 375～1 700cm-1波数范围光谱学变化

1 652 cm-1酰胺I中C-O伸缩振动引起，1 541 cm-1是蛋白质酰胺II中N-H弯曲振动和C-N伸缩振动产生[12-13]。这两个吸收峰均有蛋白质中分子振动产生，但死后经典理论认为蛋白质在蛋白水解酶的作用下发生降解，使用western blot和免疫组织化学技术对死后组织中的各类蛋白进行半定量研究均发现组织中的观察蛋白含量减少[1-2]。A1652/A1541比值反映出酰胺I和酰胺II比值在死后和离体后的改变，1 541 cm-1吸收峰峰强在死后有上升改变，说明蛋白质酰胺II带分子含量在死后增加，这和死后蛋白降解的经典理论发生了冲突。但死后组织化学变化十分复杂，它牵涉到原有物质的降解和新物质的生成，1 541 cm-1吸收峰增加并不是由于蛋白质酰胺II分子增加而引起，可能是由其它含N-H、C-N有机或者无机物质增加而导致的。这些未确定含N-H、C-N有机或无机物质死后合成的速度要快于蛋白质酰胺II降解的速度。1 396 cm-1是脂肪酸COO-振动引起[14]，该吸收峰在所有的光谱均存在，而且随着大鼠死后和人离体组织时间的延长而增加。脂肪酸是脂肪合成的必须物质，该峰增加和3 012、2 958、2 925、2 852 cm-1四个来自脂肪增加，说明死后组织脂类物质的增加。

3.3 900～1 300 cm-1波数范围光谱学变化

1 238 cm-1吸收峰来自核酸中PO-2反对称伸缩振动，1 080 cm-1吸收峰来自核酸中PO-2对称伸缩振动[9-10]。死后大鼠脾脏组织这两个吸收峰明显下降。DNA和RNA在死后由于核酸酶的作用快速降解，环境中到处存在RNA酶，故RNA在死后降解速度更快。法医学者通过不同技术方法来研究核酸死后的降解过程，如单细胞凝胶电泳、流式细胞仪、组织化学结合图像分析技术、PCR等技术分析死后核酸的降解规律[2-4]。红外光谱的方法也可以检测到核酸降解的变化，且不用对组织进行任何的破坏。

3.4 环境因素影响

随着环境温度升高FTIR光谱变化趋势增加，大鼠死后三个环境温度中FTIR光谱有着不同变化趋势。环境温度4℃，FTIR光谱在观察吸收峰峰强、峰强比没有显著变化，峰强比指标不能推断低温下尸体死亡时间。低温下死亡时间推断，FTIR光谱学技术也没有很好的解决。环境温度30℃，大鼠脾脏FTIR光谱峰强比可以看显著的变化，通过对峰强比定量检测可以很好的反应出变化规律。FTIR光谱结果可以有效的反映出20℃、30℃环境温度下，脾脏组织死后的光谱学变化。由于死后较多的因素影响着组织的化学反应，如温度、湿度、死亡原因等，故FTIR光谱技术在不同影响因素、不同组织器官的研究将进一步深入。由于大鼠和人有较好的生物相似性，本研究为后期人尸体的FTIR光谱检测提供了良好的动物实验指导和理论依据。本实验结果表明，FTIR光谱在法医死亡时间推断研究领域有可能成为新的有效方法。

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（本文编辑：秦志强）

Forensic Medical Analysis of FTIR Spectral Changes of Rat Spleen Postmortem

HUANG Ping1，2，YU Rong-jun3，LI Li1，4，KE Yong2，FAN Shuang-liang2，WANG Zhen-yuan2
（1.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine，Institute of Forensic Science，Ministry of justice，Shanghai 200063，China；2.Department of Forensic science，School of Medicine，Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061，China；3.Ningbo Public Security Bureau，Ningbo 315040，China；4.Department of Forensic Medicine，Shanghai Medical College，Fudan University，Shanghai 200032，China）

DF795.3

A

10.3969/j.issn.1671-2072.2010.05.007

1671-2072-（2010）05-0038-05

2010-04-02

国家自然科学基金资助项目（30471935）；上海市自然科学基金资助项目（09ZR1432900）

黄平（1979-），男，博士，助理研究员，主检法医师，主要从事法医病理学研究。E-mail：huangpingxjtu@gmail.com。

王振原（1964-），男，教授，博士研究生导师。E-mail：wzy218@mail.xjtu.edu.cn。