搜风祛痰法中药对AngⅡ诱导人脐静脉内皮细胞NF-κ BmRNA及ET-1mRNA表达的影响1)

丁亚芳,宫丽鸿,高 峰,刘 丹,高冬梅,杜玉杰

动脉粥样硬化(atheroscierosis,AS)是心脑血管疾病的重要病理基础,也是临床心脑血管疾病发生和引起死亡的主要原因。AS是一种特殊的慢性炎症过程,这种炎症过程源于血浆脂蛋白、各种细胞组分与动脉壁细胞外基质间的相互作用[1,2]。近年来患病人群有逐步年轻化趋势[3],严重危害人类身体健康。因此,研究内皮细胞功能及代谢的变化对探讨AS发病机制具有重要意义。血管紧张素Ⅱ(angiotensionⅡ,AngⅡ)可导致内皮细胞损伤,诱发血管炎症反应。本实验旨在研究搜风祛痰法

对血管紧张素Ⅱ诱导血管内皮细胞(EC)核转录因子(NF-κ B)mRNA及内皮素-1(ET-1)mRNA表达的影响来预防AS的发生,并为治疗AS提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 药物 活心汤组方:全蝎 15 g,蜈蚣2条,地龙20 g,陈皮15 g,半夏15 g,白术15 g,水蛭 15 g。由辽宁中医药大学附属医院中药局提供,加工制成含生药2 g/mL中药浓缩液4℃冰箱保存备用。

1.2 动物 健康新西兰大耳白兔(辽宁中医药大学动物实验中心)清洁级,雌雄不拘,体重2.0 kg～2.5 kg。

1.3 仪器 高速冷冻离心机(Sigma 3C15K美国);超净工作台(苏州净化公司);CO2恒温培养箱(THEROM HERAce11150);倒置显微镜(OLYMPUS IX71);PCR仪(Biometra UnioⅡ型,德国);紫外分光光度计(UV-3000,英国);凝胶自动成像及分析系统(Chemi Imager 5500,美国)。

1.4 试剂 AngⅡ(美国Sigma公司);胰蛋白酶(Gibco公司);DMEM(美国gibco公司);PCR引物(北京华大基因公司合成);胎牛血清(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)。

1.5 药物血清制备 随机将兔分为4组,空白对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,每组5只。后3组分别灌胃活心汤,以人临床用量×动物等效计量比值×血清稀释度为参考给药量,空白对照组给等容积的蒸馏水。连续5 d,第5天灌胃后2 h颈动脉放血,分离血清,56℃30 min灭活,低温干燥,置-80℃保存备用,临用时用DM EM培养液配成10 mg/mL的浓度,再用0.22 μ m 的微孔滤膜过滤除菌。

1.6 HUVEC培养及鉴定 人脐静脉内皮细胞株原代(辽宁中医药大学检验科提供),用含20%胎牛血清的DMEN/F12培养基在37℃CO2培养箱中培养至融合状态,再用0.25%胰蛋白酶进行消化、传代。培养的HUVEC细胞形态符合内皮细胞特征,抗人ⅤⅢ因子抗体染色阳性。将培养的第2-3代细胞用于实验。

1.7 实验分组 随机分5组:正常对照组(空白血清);AngⅡ组(0.5μ mol/L)组;低浓度中药血清+AngⅡ组:0.5 μ mol/L AngⅡ+2.5%中药血清;中浓度中药血清+AngⅡ组:0.5 μ mol/LAngⅡ+5%中药血清;高浓度中药血清+AngⅡ组:0.5 μ mol/L AngⅡ+10%中药血清。用中药血清事先孵育2 h后再加入 AngⅡ0.5 μ mol/L刺激2 h,收集细胞。

1.8 RT-PCR法测定内皮细胞NF-κ B、ET-1 mRNA 采用Trizol试剂一步法提取组织总RNA,紫外分光光度计测定纯度并定量。根据中国医科大学提供的NF-κ B及 ET-1和内参照β-actin的mRNA序列,应用软件Primer Premier 5.0自行设计引物。详见表1。

表1 引物序列表

反应条件:94℃5 min,1个循环;94℃30 s,59℃30 s,72℃1 min,35个循环;72℃5 min后结束扩增反应。取5 μ L PCR产物与2 μ L Lodding Buffer混合,进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,100 V 1.5 h,电泳结束后,凝胶成像仪成像分析。

1.9 统计学处理 SPSS12.0软件,数据以均数±标准差(±s),两组间比较用t检验,多组间比较用方差分析,相关分析采用直线相关。

2 结 果

2.1 活心汤对血管紧张素Ⅱ诱导血管内皮细胞 NF-κ B mRNA表达的影响 正常对照组 NF-κ B mRNA表达最低,AngⅡ组表达明显高于其他4组(P＜0.05)。3个中药血清组 NF-κ B mRNA表达比AngⅡ组显著降低(P＜0.05),与低浓度组中药血清相比,中高浓度中药血清组抑制NF-κ BmRNA表达更加明显(P＜0.05)。详见表1。

图1 血管内皮细胞NF-κ B mRNA表达

2.2 活心汤对AngⅡ诱导血管内皮细胞ET-1 mRNA表达的影响 正常对照组 ET-1 mRNA表达最低,AngⅡ组的 ET-1 mRNA表达明显高于其他4组(P＜0.05)。3个中药血清组ET-1 mRNA表达比AngⅡ组显著降低(P＜0.05),与低浓度组中药血清相比,中高浓度中药血清组抑制ET-1 mRNA表达更加明显(P＜0.05)。详见图 2。

图2 血管内皮细胞ET-1 mRNA表达

3 讨 论

血管内皮是位于血管腔内面的单层细胞上皮,介于血液和平滑肌之间,不仅起一种机械的屏障作用,还参与多种调节机制,因而成为血管疾病的一个基本靶点和调节点。现已证实,内皮功能紊乱贯穿于动脉粥样硬化进程的各个阶段[4]。

NF-κ B是Sen和Baltimore首先报道,是一种能与免疫球蛋白κ轻链基因增强子κ B序列特异结合的蛋白因子,具有多向转录调节作用,尤其在细胞因子诱导的基因表达中起关键性调控作用。细胞处于静息状态时,NF-κ B以无活性的三聚体形式存在于细胞质中,受到多种细胞因子激活,启动和调控相关基因转录[5]。这些因子在机体免疫应答、炎症反应和细胞生长发育等方面发挥着重要作用[6,7]。新近研究发现,NF-κ B亦存在于血管内皮细胞、血管平滑肌细胞(smooth muscle cell,SMC)及心肌细胞中,参与多种心血管疾病的发生和发展过程[8-10]。NF-κ B依赖性基因协同诱导表达,促使血管壁产生动脉硬化效应,这种效应持续存在,刺激SMCs迁移、增殖,使循环血单核细胞不断聚集,进一步产生细胞因子、化学因子、生长因子,因此 NF-κ B在致AS信号初始反应、进展中均扮演重要角色[11]。

ET是1988年日本学者Yanagisawa等从猪主动脉内皮细胞中分离纯化的一种多肽物质,是内皮细胞依赖性收缩因子的主要成分,是迄今最强的血管收缩因子[12]。ET有3种同分异构体:ET-1、ET-2和ET-3。其中 ET-1的心血管效应最强。动脉粥样硬化早期的一项病理生理变化是单核细胞向血管内膜层移行、活化并刺激多种因子释放。已在体外证实,内皮素能够作为单核细胞趋化剂使用,因此内皮素可能是动脉粥样硬化的一个始动因子,也能够刺激血管平滑肌细胞的移行和增生,从而促进动脉粥样硬化的进程[13]。

AS可涉及祖国医学痴呆、中风、胸痹、真心痛、厥心痛、痰饮等病症。本病的病理变化为本虚标实,虚实夹杂。本虚可累及心、肝、脾、肾四脏,为病之本,以痰瘀毒互阻为病之标,正虚邪实相互影响,致使病变不断发展。正如《血证论》瘀血既久亦可化痰水。随着生活水平的提高和生活方式的改变,过食肥甘厚味、嗜好烟酒,酿生痰浊瘀血的胸痹患者日益增多。痰浊能使LDL升高,LDL可使巨噬细胞产生ET-1,从而增加内皮素的形成和释放[14],AngⅡ可以使血管收缩引起血瘀,而中医有津血同源理论,且津停为痰,又认为久病入络,宜搜风通络祛痰,治血与治风相通,从痰从风论治。活心汤方中全蝎、蜈蚣具有熄风止痉、攻毒散结、通络止痛之效。地龙具有清热熄风,通络利尿之效。陈皮半夏白术三者既能燥湿化痰,又能理气健脾消痞散结。水蛭为虫类活血化瘀药,破血逐瘀而不伤新血。诸药合用共奏搜风祛痰,祛瘀通络之功效。现代药理研究证实,全蝎中含卵磷脂是胆碱的供体,可减少和清除血管壁上胆固醇的沉积,降低血液黏稠度,改善血氧供应。蜈蚣有抗心肌缺血、抗炎、镇痛、改善机体免疫功能、抗衰老等作用[15-16],地龙具有解热镇静、抗惊厥、平喘、抗血栓、降压等作用[17];陈皮提取物有明显的清除自由基、羟自由基和抗脂质过氧化作用,对自由基引起的细胞膜氧化损伤有保护作用[18],并能抗衰老、增强生命活力。水蛭能增加脑血流量,改善脑缺氧状况,降低血流黏稠度及降血脂,抑制体内外血栓形成[19]。上药合用,能够更好地起到防止动脉粥样硬化的作用。

本实验研究显示,血管紧张素Ⅱ可引起细胞内皮损伤,导致VEC功能紊乱,加剧炎症反应,致使 NF-κ B mRNA及 ET-1 mRNA表达升高,搜风祛痰法能有效地抑制细胞损伤后NF-κ B mRNA及 ET-1 mRNA表达,改善血管内皮功能,减轻内皮损伤,从而有效地防止动脉粥样硬化的发展,为治疗 AS提供理论基础,但其全面深入的作用机制还有待进一步研究探讨。

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