花椒总黄酮测定方法研究

吴亮亮，石雪萍，张卫明

（1.南京野生植物综合利用研究院，江苏南京210042；2.南京农业大学食品科技学院，江苏南京210095）

花椒总黄酮测定方法研究

吴亮亮1，2，石雪萍1，*，张卫明1

（1.南京野生植物综合利用研究院，江苏南京210042；2.南京农业大学食品科技学院，江苏南京210095）

通过紫外扫描比较了芦丁和花椒提取物在硝酸铝-亚硝酸钠和三氯化铝法两种显色体系条件下的吸收特性，结果表明，硝酸铝-亚硝酸钠显色法更适合花椒中黄酮含量的测定。硝酸铝-亚硝酸钠法线性方程y=12.275x-0.0001，芦丁浓度在0.00～0.06mg/mL范围内，浓度和吸光度呈良好线性关系，相关系数R2=0.9997，测定的平均回收率为98.86%。并测定了不同品种花椒中黄酮类化合物的含量。该方法简便、快速、准确，适合作为花椒中总黄酮含量测定的主要方法，也可以用于花椒提取物质量控制。

花椒，总黄酮，紫外-可见分光光度法

Abstract：The absorption characteristics of the rutin and Zanthoxylum extract in two chromogenic systems（A（lNO3）3-NaNO2chromogenic system and AlCl3chromogenic system）by U∨-∨is scanning method.The results showed that the A（lNO3）3-NaNO2chromogenic system was suitable to detect total flavonoids in Zanthoxylum.Linear equation of A（lNO3）3-NaNO2was y=12.275x-0.0001（R2=0.9997），the recovery of standard addition was 98.86%.The concentration of the Zanthoxylum from different areas was detected using this method.This method was easy to operate，fast and accurate，and it was suitable to detect the total flavonoids in Zanthoxylum.It could also be used on quality control of the Zanthoxylum extract.

Key words：Zanthoxylum；total flavonoids；U∨-∨is spectrophotometry

花椒（Zanthoxylum）属芸香科，全世界约有250种，其中在我国约有45种，13个变种。主要品种为青花 椒（Z schinifolium Sieb.et zucc）和 红 花 椒（Z.bungeanum Maxim）［1］。花椒在我国常作为一种食品调味料使用，气味辛香麻辣，被誉为“八大味”之一。也是一种传统中药材，具有温中散寒、除湿、杀虫、止痛等作用［2-3］。黄酮类化合物泛指两个芳环通过三碳链相互联结而成的一系列化合物，基本结构为C6-C3-C6，广泛存在于植物界中，在植物体内大部分与糖结合成苷，部分以游离形式存在［4］。目前报道的测定植物中总黄酮含量的方法主要是可见光分光光度法［5］，但测定花椒总黄酮含量的方法未见报道。本文采用硝酸铝-亚硝酸钠体系显色，可见光光度法测定花椒中总黄酮含量，同时对不同产地的青花椒和红花椒中总黄酮含量进行了测定。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

花椒 市售；芦丁标准品 中国药品生物制品鉴定所；乙醇、氢氧化钠、九水合硝酸铝、硝酸钠 均为国产分析纯；纯净水。

T6紫外/可见光分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；KQ3200E型超声清洗器 昆山市超声仪器有限公司；JA3103N分析天平 上海明桥精密科学仪器有限公司；SHB-IIIA循环水式多用真空泵河南省太康科教仪器厂；高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品溶液的制备 准确称取粉碎干燥的花椒粉2.0g，用60mL 60%乙醇作为溶剂，在30℃下超声提取（超声功率 150W；超声时间 1h；超声温度25℃），经抽滤，即得样品液。

1.2.2 对照品溶液制备 精密称取105℃下干燥恒重的芦丁纯品20mg，用无水乙醇溶解，摇匀，定容至100mL，即得0.2mg/mL的芦丁标准品溶液，作为贮备液备用。

1.2.3 显色试剂制备 准确称取44g九水合硝酸铝于烧杯中，用少量水溶解后转移至250mL容量瓶中，用纯净水定容，配成10%的溶液待用。分别配制5%的亚硝酸钠和10%的氢氧化钠溶液于试剂瓶中，待用。精密称取AlCl31.34g，甲醇定容至100mL，配成0.1mol/L 的溶液［6-7］。

1.2.4 两种黄酮的测定方法紫外扫描

1.2.4.1 亚硝酸钠-硝酸铝法 精密移取0.5mL芦丁标准液和花椒提取液于20mL的干净试管中，另取5.0mL无水乙醇于一支试管中，各管均加5%亚硝酸钠溶液1.0mL，混匀，放置6min；加10%硝酸铝溶液1.0mL，摇匀，放置6min；加10%氢氧化钠试液10mL，用乙醇补齐至20mL摇匀，显色15min。以无水乙醇管为空白，在400～600nm波长下进行紫外-可见扫描。

1.2.4.2 三氯化铝法 精密吸取上述芦丁标准液0.5mL与花椒提取液于20mL的试管中，加70%乙醇5mL稀释，另取一只试管加入5mL 70%乙醇，各管均加入0.1mol/L AlCl32mL，并用纯净水稀释至刻度，摇匀，显色15min。以乙醇管为空白，在300～500nm范围内进行波长扫描。

1.2.5 标准曲线绘制 分别准确吸取0.2mg/mL的芦丁溶液 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，按照亚硝酸钠-硝酸铝法显色，在波长508nm处以第一管为空白测定吸光度。以吸光度A为纵坐标，浓度C为横坐标，绘制校正曲线。

1.2.6 样品测定 精密移取0.1mL提取液于20mL的干净试管中，另取5.0mL无水乙醇于一支试管中，各管均加5%亚硝酸钠溶液1.0mL，混匀，放置6min；加10%硝酸铝溶液1.0mL，摇匀，放置6min；加10%氢氧化钠试液10mL，用乙醇补齐至20mL摇匀，放置15min。显色稳定后，分光光度法在最大吸收波长处以无水乙醇管为空白测定吸光度，并从校正曲线上读取相应的浓度（mg/mL），根据浓度计算花椒黄酮提取率。黄酮提取率的计算公式如下：

黄酮提取率（%）=提取液中的黄酮总量（g）/花椒原料量（g）×100%

2 结果与讨论

2.1 两种方法扫描结果

硝酸铝-亚硝酸钠显色法和三氯化铝显色法是黄酮测定中常用的两种方法。从图1紫外-可见光扫描结果可以看出，花椒提取物在三氯化铝显色反应体系进行波长扫描结果表明，在410nm左右吸收峰比较小，和芦丁对照品比较，吸收特性有很大差异；而硝酸铝-亚硝酸钠显色体系中，芦丁和花椒提取液吸收峰几乎重合，并且在508nm出现最大吸收峰，由此推测花椒提取物中含有较多的邻二酚羟基的黄酮、黄酮醇、二氢黄酮等黄酮类化合物。由此可见，三氯化铝显色法不适用花椒中黄酮含量的测定。因此选择硝酸铝-亚硝酸钠显色体系，508nm下对花椒黄酮进行测定。

图1 两种显色方法下芦丁和花椒提取物的紫外可见扫描图谱

2.2 校正曲线绘制

芦丁在硝酸铝-亚硝酸钠显色体系中浓度与吸光度值关系如图2所示，芦丁在浓度为0～0.06mg/mL内，与其吸光度呈良好线性关系，在此范围内的线性回归方程为 y=12.275x-0.0001，相关系数 R2=0.9997。

图2 芦丁标准曲线

2.3 重现性考察

精密称取花椒粉（茂汶红花椒）5份，每份2g，按照亚硝酸钠-硝酸铝法进行测定。将吸光值代入图2标准线，求得提取液中黄酮相应浓度，相对标准偏差RSD=2.45%，见表1。

表1 精密度实验（n=5）

2.4 稳定性考察

将提取的样品（茂汶红花椒），按照亚硝酸钠-硝酸铝法，每隔5min测定一次吸光度，在15min内，吸光值基本稳定，RSD=1.29%，所以在此时间范围内稳定性最佳，见表2。

表2 稳定性实验

2.5 回收率实验

精密吸取0.1mL已知黄酮浓度的样品液（茂汶红花椒）到5支干净试管中，分别加入0.1mg/mL芦丁标准液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL，按照亚硝酸钠-硝酸铝法测定吸光度，计算结果见表3。

表3 回收率实验结果（n=5）

2.6 四种花椒总黄酮含量比较

按照1.2.6方法对四种花椒提取液进行总黄酮含量测定，茂汶红花椒的总黄酮含量最高，达194.4mg/g，其次云南青花椒189.0mg/g，韩城红花椒167.4mg/g，四川青花椒最少，为162.0mg/g。

3 讨论

本文以芦丁为对照品，硝酸铝-亚硝酸钠显色法来测定花椒中总黄酮的含量，该法的原理是在待测物的水溶液中，加入亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠试液，铝离子与黄酮类化合物3，4-二羟基发生络合反应显色来进行测定。

此方法进行总黄酮的含量测定影响因素很多，其一，某些具有邻二酚羟基类化合物也会和铝离子络合显色，例如含多羟基的酚酸、有机酸类化合物，如咖啡酸、绿原酸等；其二，某些黄酮类成分与铝离子络合，不在500nm左右处有最大吸收，影响测定结果，使测定结果偏小；其三，某些总黄酮类化合物中不含或仅含有少量芦丁，但是很多研究者仍然用芦丁做对照品测定总黄酮含量，则测定结果与实际总黄酮含量会有差别，不能准确定量。前期实验表明，花椒中含有大量的芦丁成分（实验结果已另文发表）。紫外-可见光扫描结果也显示，对照品和花椒样品硝酸铝-亚硝酸钠显色后的吸收曲线几乎重合，也进一步说明了此方法的合理性与可行性。

实验结果表明，花椒中含有生物类黄酮，不同产地的花椒，生物类黄酮含量有一定差异。对花椒中的黄酮进行含量测定，为花椒进一步开发生产纯天然、无毒副作用及具有多功能保健和医疗作用的食品、药品提供理论依据。本法以芦丁为标准，采用硝酸铝-亚硝酸钠体系显色，以508nm为测定波长测定花椒中的总黄酮含量，其加标回收率和重现性均较好，可作为花椒总黄酮含量测定的方法。四种花椒总黄酮含量测定比较发现，总黄酮含量均在162.0mg/g以上，茂汶红花椒黄酮含量最高，是作为后期花椒黄酮研究的首选材料。

［1］中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志［M］.北京：科学出版社，1981.

［2］刘雄，阚建全，陈宗道，等.花椒风味成分的提取［J］.食品与发酵工业，2003，29（12）：62-66.

［3］本草纲目［M］.重庆：重庆出版社，2006.

［4］严敏，唐筱露.黄酮类化合物抗病毒作用研究概况［J］.亚太传统医药，2009，5（9）：149-150.

［5］Jia Zhishen，Tang Mengcheng，Wu Jianming.The determination offlavonoid contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals［J］.Food Chemstry，1999，64：555-559.

［6］丁明玉，赵纪萍，李擎阳.贯叶金丝桃提取物中总黄酮的测定方法［J］.分析实验室，2001，20（6）：45.

［7］张锡瑜.分析化学原理（第2版）［M］.北京：科学出版社，2000：398.

Study on the determination method of total flavonoids content in Zanthoxy/um by spectrophotometry

WU Liang-liang1，2，SHI Xue-ping1，*，ZHANG Wei-ming1
（1.Nanjing Institute for Comprehensive Utilization of Wild Plant，Nanjing 210042，China；2.School of Food Science&Technology，Nanjing Agriculture University，Nanjing 210095，China）

TS201.2

A

1002-0306（2010）10-0372-03

2009-11-13 *通讯联系人

吴亮亮（1986-），男，研究生，主要从事食品功能成分研究与开发。

国家“十一五”科技支撑计划重点课题（2006BAD06B02）。