裂殖壶菌发酵生产DHA研究进展

魏 萍，马小琛，任路静，纪晓俊，何光华，刘 臻，黄 和，*

（1.南京工业大学生物与制药工程学院，材料化学工程国家重点实验室，江苏南京210009；2.浙江贝因美科工贸股份有限公司，浙江杭州310007）

裂殖壶菌发酵生产DHA研究进展

魏 萍1，马小琛1，任路静1，纪晓俊1，何光华2，刘 臻2，黄 和1，*

（1.南京工业大学生物与制药工程学院，材料化学工程国家重点实验室，江苏南京210009；2.浙江贝因美科工贸股份有限公司，浙江杭州310007）

DHA是一种重要的多不饱和脂肪酸，裂殖壶菌（Schizochytrium）因富含DHA成为当前国内外研究热点。本文介绍了Schizochytrium及其合成DHA的代谢机理，并对国内外Schizochytrium发酵生产DHA的水平、发酵底物、发酵工艺进行综述。基于目前发酵状况，提出了DHA发酵过程中存在的问题，并指出选育高产稳定菌株、对合成DHA代谢途径及关键酶进行研究、改进合适的生物反应器并进一步应用数学工具优化发酵工艺是今后的研究重点。

裂殖壶菌，DHA，发酵

Abstract：DHA is an important polyunsaturated fatty acid.Schizochytrium has captured an international research hotspot because of its abundant content of DHA.In this article，Schizochytrium and its metabolic mechanism for DHA biosynthesis，the production level，fermentation substrates and fermentation technology were introduced.In view of the present research situation，the problems existed in DHA fermentation process were also mentioned.It is pointed out that the future research emphasis should be placed on screening high-yield and stable microbe strains，investigating the key enzymes involved in the lipid biosynthesis，designing an appropriate bioreactor for DHA production and using the mathematic tools to optimize the fermentation process.

Key words：Schizochytrium；DHA；fermentation

二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，简称DHA）是重要的ω-3多不饱和脂肪酸，俗称“脑黄金”，具有促进脑细胞生长发育、降血脂、降血糖、保护视力、抗癌及提高免疫能力等多种重要的生理功能，被誉为新一代功能保健因子，受到世人极大的关注。传统深海鱼油提取的DHA受鱼的品种、季节及地理位置的影响而不稳定，且胆固醇和其它不饱和脂肪酸含量高，导致DHA产量有限、分离纯化困难，成本较高等问题。随着鱼油原料来源日渐紧缺，难以实现DHA这种高附加值产品在食品和医药等行业中的广泛应用。微生物发酵法生产DHA可克服传统鱼油提取的不足，可用于大量生产DHA，不断满足人们的需求，具有广阔的应用前景，备受国内外学者关注。能够合成DHA的微生物主要是一些低等海洋真菌和微藻，如破囊壶菌（Thraustochytrium）、裂殖壶菌（Schizochytrium）、隐甲藻（Crythecodinium cohnii）等。而Schizochytrium因其生长速度快、易于培养、细胞内脂肪酸和DHA含量高等优势，具有更大的应用价值，是目前进行工业化生产DHA的理想物种之一［1］。

1 裂殖壶菌概述

1.1 裂殖壶菌介绍

Schizochytrium又称裂壶藻，属于真菌门（Eumycota）、卵菌纲（ Oomycetes）、水霉目（Saprolegniales）、破囊壶菌科（Thraustochytriaceae）的一类类藻的海洋真菌，单细胞、球形。目前已有五个种被分离出，分别是：S.aggregatum、S.minutum、S.octosporum、 S.mangrovei 和 S.limacinum。Schizochytrium细胞积累大量对人体有用的活性物质，如：油脂、色素（类胡萝卜素、叶黄素、虾青素等）、角鲨烯［2］等，其中油脂占细胞干重的70%以上，总脂肪酸中DHA的质量分数高达35%～45%，且细胞中90%以上的油脂以人体易吸收的中性油脂——甘油三酯（TG）形式存在，还有的是以卵磷脂（PC）形式存在，如 1-棕榈-2-DHA-PC 和 1，2-双-DHA-PC［3］。

表1 国内外代表机构用Schizochytrium发酵产DHA水平概况

对于Schizochytrium的安全性评价，Hammond等人进行了全面、详细的研究，包括对大鼠的亚急性毒性实验［4］、对大鼠和兔子发育的毒性实验［5］、对大鼠生殖影响的实验［6］、对大鼠的诱变实验［7］以及对猪发育的安全性评价［8］，均未发现有任何毒副作用。且其安全性已得到美国食品药品管理局局（Food and Drug Administration）的认可，能开发医药、食品（尤其是孕妇、哺乳期妇女和儿童食品）以及饲料等系列产品。美国已经批准Schizochytrium为GRAS（Generally Recognised as safe）级营养添加物，推荐的每日摄入量为1.5g。

1.2 裂殖壶菌合成DHA代谢机理

在生物体内，长链多不饱和脂肪酸的合成是一个碳链延长和耗能的过程，需要物质乙酰-CoA、不同种类的酶和NADPH提供的能量。其中乙酰-CoA不能直接穿出线粒体膜，主要通过胞浆中的柠檬酸转运体系到达胞浆，经柠檬酸裂解酶得到乙酰CoA和草酰乙酸。草酰乙酸在苹果酸脱氢酶和苹果酸脱梭酶的作用下，产生NADPH提供脂肪酸合成中所需要的还原力，产生的乙酰-CoA作为脂肪酸合成的起始物质。在乙酰CoA和NADPH充足供应的基础上，长链多不饱和脂肪酸是如何合成的呢？绝大多数的微生物体内多不饱和脂肪酸通常由单不饱和脂肪酸和脂肪酸油酸开始，并通过脂肪酸合成酶（FAS）和一系列去饱和酶催化完成。近年来，许多研究者发现Schizochytrium合成DHA存在新的途径。Metz［9］等通过对Schizochytrium sp.ATCC20888多不饱和脂肪酸合成酶3个亚基的开放阅读框对比分析以及14C同位素标记推断：Schizochytrium极有可能通过聚酮合酶（PKS）催 化 合 成 DHA。Wallis［10］等 人 也 揭 示Schizochytrium体内DHA生物合成不依赖碳链延长与脱氢反应，他们的研究成果进一步揭示了DHA合成存在新的机制。2003年，Martek公司成功攻克了Schizochytrium中编码PKS途径中相关酶的基因序列［11］，并于2006 年对 Schizochytrium sp.中长链多不饱和脂肪酸合成酶以及I型的脂肪酸合成酶进行研究，提出在Schizochytrium sp.体中DHA和DPA只需由长链多不饱和脂肪酸合成酶合成，而短链的饱和脂肪酸（C14∶0和 C16∶0）主要通过 I 型的脂肪酸合成酶合成［12］。以上研究充分说明，Schizochytrium体内DHA的合成过程并不涉及脂肪酸脱氢酶和去饱和酶催化过程，而是由PKS途径合成。这一重要发现将为Schizochytrium产DHA的代谢调控研究提供新的思路和方法。但是对于DHA的具体合成机理仍不清楚，有待进一步研究。

2 裂殖壶菌发酵DHA研究水平概述

八十年代初随着人们对PUFAs生理作用认识的加强，DHA的生物合成引起了人们的极大关注。国外对发酵产DHA的研究较早，且DHA的生产在日本和一些欧美国家已进入工业化生产阶段。最早将Schizochytrium应用于商业化生产的是美国的Omega生物技术公司。早在1991年，该公司就研究出了一套Schizochytrium的培养工艺，培养48h后，菌体的生物量可达20g/L，DHA达细胞干重的10%［13］。10多年前，Martek生物科技收购了Omega生物技术公司，并已成功筛选出异养培养生产富含DHA的菌种，并在培养条件上进行了深入探索，将DHA产量提升到40～45g/L［14］，并奠定了该公司在 DHA 生产市场的主导地位。近年来国内一些科研机构如厦门大学、浙江大学、南京工业大学等对 Schizochytrium发酵产DHA进行研究，见表1，并取得一定进展，但产量和质量均较国外尚有一定差距，导致很多化妆品及食品行业仍需要进口的微胶囊DHA。

3 发酵底物

Schizochytrium生长需要提供足够的碳源和氮源。碳源和氮源的数量和来源对其合成DHA有重要的影响，见表2。Wu［23］等发现葡萄糖、果糖和甘油DHA生产是较适的碳源，而二糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、多糖和可溶性淀粉都适合Schizochytrium sp.S31细胞的生长和脂质的积累，但不适合DHA的生产。Schizochytrium较多地利用有机氮源，如酵母抽提液、谷氨酸、胰胨、玉米浆等，但 Nakaharal［24］发现，无机氮源（NH4）2SO4是玉米浆良好的替代源，且可以用来调节培养基的pH。Ganuza［16］等采用分批发酵，在培养基中不断通入NH3，该通入的NH3不仅使培养保持一定pH，还可以作为氮源，最终DHA含量高达15.75g/L。在所有底物中，葡萄糖和酵母提取液是最常用的碳源和有机氮源。近年来研究者开始利用一些废料或粗粮作为底物，以期望达到废物再利用、节约粮食和降低成本，如Chi［25］等利用生物柴油副产物甘油作为Schizochytrium limacinum的原料发酵产DHA，其生物量达22.1g/L，DHA产量达4.91g/L，结果表明，生物柴油副产物甘油是Schizochytrium生产DHA很好的原料。Yamasaki［26］等利用酒厂废水作为原料，DHA的产量达3.4g/L。以上研究充分说明，Schizochytrium能利用廉价废弃生物质资源发酵生产DHA。虽然Schizochytrium使用有些底物时，DHA的产量并不高［30］，但为工业降低成本提供了新的研究思路和方向。

表2 不同发酵底物对Schizochytrium生产DHA的研究

4 发酵工艺

4.1 两步发酵法

Schizochytrium培养分为细胞生长/分裂阶段和脂质积累阶段，学者们采用两步发酵法即采用分批发酵培养和培养条件改变，从而实现其高密度发酵和油脂在体内的大量积累。在细胞生长/分裂阶段需要提供足够的营养以满足细胞生长繁殖的蛋白质、核苷等的合成。氮源的限制是油脂合成启动的前提［30］，因此油脂积累阶段应适当限制氮源。Schizochytrium是需氧异养微生物，但DHA是通过厌氧途径PKS合成，因此氧气控制也是两步发酵中的关键因素，Bailey［14］等采用分批发酵方式培养Schizochytrium，在发酵过程中不断添加玉米糖浆，保持糖的浓度为7g/L，并使用硫酸钠作为主要的钠盐，且在细胞的细胞生长/分裂期保持氧气浓度大于4%，而在脂质积累期保持氧气浓度低于3%，并限制氮源，仅发酵90～100h，生物量高达200g/L，总脂肪酸是生物量的40%，且 DHA 高达 40～45g/L。Chi［31］等也采用转化溶氧法，在细胞数量生长期控制溶氧为50%，在油脂积累期控制溶氧为10%，该两步溶氧控制使Schizochytrium的生物量和DHA含量分别提高到 37.9g/L 和 6.56g/L。Jakobsen［32］等在油脂积累阶段采用N，P限制和O2限制，生物量达到90～100g/L，相比无O2限制情况下，DHA占总脂肪酸含量由36%提高到52%。该两步发酵法不仅适合ω-3多不饱和脂肪酸的生产，也适合其它单细胞油脂的生产。

4.2 代谢调控研究

国内外对Schizochytrium的研究主要集中在菌种的诱变和筛选，发酵条件的优化［15-19］，如：碳源、氮源、碳氮比、无机盐、前体促进物质以及溶氧、pH等方面的研究。近年来，随着对DHA合成机理进一步地认识，研究者开始对合成DHA的代谢调控进行研究，并已经取得初步进展。2005年，已初步阐明了AMP脱氢酶、柠檬酸裂解酶、苹果酸酶的活性变化与甘油三酯积累的活动的关系［33］，其中苹果酸酶是NADPH的提供者。脂肪酸合成的两个关键物质是乙酰-CoA和NADPH［30］，乙酰-CoA 是油脂合成的前体，NADPH为DHA的合成提供还原力，这两种物质的充足供应是保证脂肪酸不断积累的重要因素。本课题组前期在总脂快速积累期，强化了乙酰-CoA和NADPH的供给，并添加4g/L苹果酸，DHA占总脂的含量由35%提高到60%［20］。此外，向培养基中加入小分子还可对脂肪酸的分布进行调控，Schizochytrium合成的总脂肪酸中，其它脂肪酸尤其是十四烷酸（C14∶0）、软脂酸（C16∶0）和二十二碳五烯酸（DPA）含量较高。Shirasaka［34］等向培养基中加入氰钴胺后，奇数碳脂肪酸如十五烷酸（C15∶0）和十七烷酸（C17∶0）显著降低；当加入甲苯甲酸后，DPA含量显著降低，并能显著降低DPA/DHA的值。

5 研究展望

随着水产养殖业的迅速发展和DHA在食品和药品等行业的应用，人们对DHA的需求将不断扩大，通过Schizochytrium发酵产DHA具有深远的意义和市场应用价值。目前基因工程和代谢工程对Schizochytrium基因改造和代谢途径的分析，DHA的发酵生产确已取得一定的进展，但使其大规模化生产尚需不懈努力。Schizochytrium发酵生产DHA过程中存在细胞生长不稳定、细胞活力不高、油脂含量少及细胞代谢难以调控等难题。今后应进一步深入研究以下几个方面：

重视高产DHA的Schizochytrium的选育。优良的菌种是DHA高产的首要因素，如何才能培养出稳定和油脂含量高的Schizochytrium是DHA高产的关键，因此需要加强多种方式选育和基因工程改良等方面的研究。特别是研究基于代谢途径分析对DHA高产菌进行选育，加强主代谢流、强化能量代谢着重选育生长稳定、活力高、细胞大小均一的DHA高产菌。

分析DHA的合成机理。进一步深入地研究DHA的合成途径、调节机制和酶的作用过程，尤其是加强对PKS途径、合成DHA关键酶学性质的研究，减少其它脂肪酸含量，定向指导DHA的高效合成。

改进适合Schizochytrium发酵产长链不饱和脂肪酸的新型生物反应器。探索发酵罐培养条件，对发酵罐流体力学（CFD）进行研究，在发酵过程进行动力学分析的基础上利用数学工具优化发酵过程，解决发酵过程中高黏度体系下氧传递、传热、传质慢等发酵瓶颈问题，以优化发酵工艺，从而创造适合Schizochytrium的生长及产油的环境。

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Research progress on DHA production by Schizochytrium

WEI Ping1，MA Xiao-chen1，REN Lu-jing1，JI Xiao-jun1，HE Guang-hua2，LIU Zhen2，HUANG He1，*
（1.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，China；2.Zhejiang Beingmate Science，Industry and Trade Co.，Ltd.，Hangzhou 310007，China）

TS201.3

A

1002-0306（2010）10-0398-05

2009-10-15 *通讯联系人

魏萍（1985-），女，研究生，研究方向：DHA发酵。

国家重点基础研究发展计划（973计划）（2007CB707805）；江苏省普通高校研究生科研创新计划（CX07s-032z）资助。