癫痫患者血浆神经肽Y与免疫细胞的水平变化及其临床意义

汪 纯，戢翰升

癫痫是由于多种原因引起的大脑神经元异常过度放电，造成脑功能暂时性的障碍。尽管目前发病机制尚不明确，但有研究表明神经系统、内分泌系统及免疫系统都参与了癫痫的发生、发展[1，2]。目前对癫痫与三者关系的单方面研究较多，但将三者联系起来去探讨癫痫的发病机制的尚少，本文对癫痫患者不同时期外周血中免疫细胞和神经肽（NPY）的水平进行测定及比较，探讨癫痫形成的神经-内分泌-免疫机制及其临床意义。

1 对象与方法

1.1 检测对象 2007-06～2009-06在笔者所在医院神经外科住院的36例颞叶癫痫患者，其中男18

例，女18例；年龄9～46岁，平均25.4岁；病程2～21

年，平均8.9年；近6个月发作频率1～12次/月，平均5.9次/月。病例入选标准：①具有典型的颞叶癫痫发作的临床表现；②24 h视频脑电图显示前或前中颞癫痫样放电；③MRI显示颞叶内侧病灶、海马硬化。所有受检对象均同时满足以下条件：①入院前24 h内无癫痫发作；②非肿瘤及占位引起的癫痫；③无传染病或炎症性疾病；④无急性严重的神经疾病（脑梗死，脑出血，脑炎等）；⑤2周内未受过外伤及手术；⑥0.5年内未用过激素和免疫抑制剂；⑦无肝肾功能不全；⑧无肾上腺皮质或下丘脑垂体异常疾病；⑨无严重精神疾病；⑩非孕期及月经期妇女。

1.2 试剂和仪器 单克隆抗体抗CD3FITC、抗CD4PE、抗CD8PE、抗 CD19PE及 CD16+56PE均由美国 Becton Dickinson 公司生产，CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD16+CD56+分别代表总 T、Ts、TH、NK 细胞。红细胞裂解液由BD公司生产。FACSCalibur流式细胞仪为美国Becton Dickinson公司产品，神经肽Y放免试剂盒为深圳晶美公司产品，全自动微粒子化学发光免疫分析系统为美国贝克曼库尔特公司产品，全自动血球计数仪为美国库尔特公司产品。

1.3 检测方法 所有患者均在入院时、入院10 min内和24 h分别抽取静脉血4 ml进行检测,一部分通过全自动血液分析仪进行白细胞计数和分类；另一部分进行淋巴细胞亚群和神经肽Y检测。外周血淋巴细胞亚群检测：样品测定管中各加100 μl肝素抗凝血，加入上述单抗20 μl，振荡混匀，室温避光20 min，染色；加入1.5 ml红细胞裂解液，混匀后室温避光放置10 min，破坏红细胞；离心半径8 cm，1 500 r/min离心5 min，弃上清；每管加入2 ml PBS，混匀，1000 r/min 离心 5 min，弃上清；加 PBS 1 ml，混匀，2 h内检测。以前向角散射光（FSC）为横坐标，侧向角散射光（SSC）为纵坐标，对淋巴细胞进行设门，吸获10 000细胞用Cell Quest软件进行检测分析。神经肽Y测定：取2 ml静脉血注入含10%EDTA二钠30 μl和抑肽酶40 μl的试管中混匀，立即在4℃，3 000 r/min离心10 min分离血浆，置-40℃冰箱保存待检。按试剂盒说明书进行并计数。

1.4 统计学处理 采用SPSS16.0软件作数据处理，计量资料先求出均数±标准差，三组间比较采用单因素方差分析，NK细胞与神经肽水平之间采用相关分析。

表 1 癫痫患者不同时间点免疫细胞及神经肽Y水平（±s)

表 1 癫痫患者不同时间点免疫细胞及神经肽Y水平（±s)

与对照组相比，*P<0.05，与入院10 min内相比，▲P<0.05

细胞类型 入院时 入院10 min内 入院24 h白细胞（109/L） 5.93±1.19 8.69±1.71* 6.48±0.60淋巴细胞（109/L） 2.12±0.62 2.85±1.07* 2.40±0.71中性粒细胞（109/L） 3.20±0.82 4.15±1.32* 3.49±0.88嗜碱粒细胞（109/L） 0.02±0.004 0.04±0.01 0.03±0.01嗜酸粒细胞（109/L） 0.21±0.06 0.20±0.07 0.19±0.05单核细胞（109/L） 17.23±6.38 14.21±6.82 17.51±4.62 B 细胞（109/L） 9.75±3.45 8.90±3.15 10.24±3.97 CD3+（%） 65.87±4.38 62.20±5.10* 66.32±4.70 CD4+（%） 43.38±5.32 37.26±6.28* 44.41±6.67 CD8+（%） 23.17±5.05 28.49±5.41* 22.87±5.26 CD4+/CD8+ 1.96±0.89 1.53±1.01* 2.07±0.94 NK（%） 12.38±5.28 21.29±6.21* 13.45±6.32 NPY（ng/L） 210.46±43.85 321.35±52.94* 243.68±48.62▲

2 结果

免疫细胞及神经肽Y的测定结果见表1。癫痫患者入院10 min内与入院时相比较外周血中白细胞总数、中性粒细胞、淋巴细胞、CD8、NK细胞及神经肽 Y 的水平均明显升高 （P<0.05），CD3、CD4、CD4/CD8明显降低 （P<0.05），其中CD4细胞降低13%；入院后24 h上述变化与入院时相比较无显著性差异（P>0.05），血浆神经肽Y与血浆NK细胞变化呈正相关（r=0.839，P<0.05）。

3 讨论

自1977年Besedovsky提出 “免疫-神经-内分泌网络”学说后，癫痫发病的网络机制得到国内外学者广泛重视并在探讨癫痫发病机制方面进行了深入的研究[2]。癫痫患者体内神经系统、免疫系统、内分泌系统三大调节系统存在密切而复杂的相互关系。三大系统之间通过双向调节作用维持机体正常的生理活动，所以无论哪个系统出现问题都可以影响整个系统的平衡，促进癫痫的发作。研究癫痫的神经免疫机制对临床治疗有重要的指导意义。本研究系通过探讨颞叶癫痫患者发作后不同时间外周血免疫细胞和神经肽Y浓度的变化，从免疫调节分子水平和细胞免疫学水平上探讨癫痫神经免疫学发病机制。

有研究表明药物也可引起免疫细胞的变化，笔者采用患者入院时为对照进行研究，排除了药物的影响，结果示入院后10 min内外周血白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、CD8、NK细胞明显升高。CD3、CD4、CD4/CD8 明显降低（P<0.05），单核细胞、嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞无显著性差异（P>0.05），提示炎症反应参与癫痫发作，癫痫发作可引起机体免疫细胞的改变，免疫调节网络处于失衡状态。NK细胞和中性粒细胞是早期抗感染的重要效应细胞，当癫痫病灶放电，扩散，通过神经-内分泌-免疫网络系统造成神经内分泌系统功能改变，使NK细胞和中性粒细胞迅速从细胞池中释放到外周血中。目前认为NK细胞具有免疫调节作用，它对淋巴细胞功能也有重要影响[3，4]。T淋巴细胞对机体所有体液免疫和细胞免疫类型均有重要的调节作用。CD3代表总T细胞水平，反映机体总的细胞免疫状态；CD4协调B细胞分化产生抗体，CD3、CD4T淋巴细胞的减少必然导致免疫功能低下，CD4细胞的降低也证明在对炎症的直接反应中CD4细胞并不起主导作用[5]。CD8又分为T抑制细胞或细胞毒T细胞，其通过自身及抑制因子在免疫反应中起负向作用，抑制CD4细胞和B细胞功能，从而抑制抗体形成及细胞免疫反应。CD4/CD8比值保持动态平衡，以维持机体细胞免疫功能的稳定，比值降低说明机体T细胞亚群失衡，提示机体免疫功能低下。有文献报道，CD3、CD4的含量和CD4/CD8比值降低可刺激B淋巴细胞分泌抗体形成免疫复合物、激活补体，使机体致病[6]。本文结果示入院24 h后外周血中免疫细胞与入院时无显著性差异，说明这种免疫细胞的变化并不持久，癫痫发作时不仅抽搐本身对机体有损害，免疫系统的异常对机体也有潜在损伤，提示在癫痫发作时不仅要控制发作症状，也需对免疫系统进行调节预防再次发作；同时通过检测外周血中24 h后免疫细胞的变化，可以排除因肿瘤、感染、脑膜炎、缺血性疾病等引起的癫痫。癫痫发作时的应激状态以及脑部潜在的结构和功能异常均可引起免疫系统的异常，因此患者外周血中T淋巴细胞亚群及NK细胞的变化只是机体癫痫发作时免疫状态的一个侧面反映。

NPY在脑中起着神经递质和神经调质的作用，主要分布在大脑皮层、丘脑及脑干，尤以海马浓度最高，而大脑边缘系统海马区与免疫系统关系最为密切，海马神经元异常电活动是许多类型癫痫的始动因素[7]，故NPY与癫痫的关系日益受到重视。本文结果表明癫痫发作后血浆中NPY显著增加，这与国内外研究结果一致[8，9]，但24 h后与入院时比较无显著性差异。关于癫痫发作时NPY合成增加的机制目前尚不清楚，一般认为有以下几方面：①脑源性因素：Reibel等[10]认为脑源性神经营养因子（BDNF）是NPY合成增加原因之一，它对人类癫痫发病的病理生理作用是通过改变NPY的表达及其免疫反应性而发挥作用的，此外兴奋性谷氨酸神经传递能调节NPY的表达，γ-氨基丁酸（GABA）A受体γ亚单位反义寡核苷酸也能引起NPY表达增高[11]；②外周因素：李亚军等[12]发现在大鼠电惊厥前后血浆中NPY和NE含量成正相关，NPY与去甲肾上腺素（NE）共同处于交感神经末梢，并常与NE一起释放。癫痫发作时机体处于应激状态，交感神经兴奋性增强，去甲肾上腺素等释放增多，故NPY释放量增多并可能通过某种途径释放入血。此外在血小板中发现与NPY合成相关联的信息RNA，表明血小板有合成NPY的能力。在病理状态下，血小板被激活释放NPY，可能作为血小板-血管间的一种传递，直接与其它血管活性物质协同作用发挥生物效应，引起癫痫发作后血中NPY含量增加。同时笔者发现NK细胞变化与NPY之间存在正相关性，随着NPY浓度的增高免疫细胞也升高。癫痫发作引起中枢和外周神经内分泌系统的广泛改变，通过海马以及海马以外部位使脑内NPY浓度升高，引起下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴、交感神经-肾上腺髓质轴（SAM）功能亢进。Wahleste等用NPY灌注清醒、自由活动鼠的室旁核和脑室，可使ACTH和糖皮质激素（GC）分泌增加。GC是一种公认的免疫抑制剂抑制淋巴细胞分裂增殖，引起免疫力低下；另外交感神经兴奋后其末梢释放的儿茶酚胺类物质，它通过与淋巴细胞膜表面上的受体介导调节淋巴细胞的功能。可见癫痫发作时海马-NPY-垂体-肾上腺轴对机体的免疫功能起着调节作用。

综上所述，癫痫患者存在免疫功能的低下，癫痫发作后血浆NPY含量明显增加，NPY可能参与了免疫功能的调节。通过检测不同时期外周血中免疫细胞和NPY的变化，可以排除因肿瘤、感染、脑膜炎、缺血性疾病等引起的癫痫，是一种简单而重要的辅助诊断手段；同时在癫痫治疗时应辅以免疫调节治疗。

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