PEPCK不同启动子调控报告基因表达效率的比较

王学斌，冯洁，杨玉琴，谢建云，陈国宏

(1.扬州大学动物科学与技术学院，扬州 225009;2.上海实验动物研究中心，上海市实验动物质量监督检验站，上海 201203;3.复旦大学，上海 200032)

综述·进展

研究报告

PEPCK不同启动子调控报告基因表达效率的比较

王学斌1，冯洁2，杨玉琴3，谢建云2，陈国宏1

(1.扬州大学动物科学与技术学院，扬州 225009;2.上海实验动物研究中心，上海市实验动物质量监督检验站，上海 201203;3.复旦大学，上海 200032)

目的构建两种不同的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)基因启动子调控报告基因表达质粒，比较该启动子在各种细胞系中的表达效率。方法采用PCR克隆大鼠PEPCK启动子1323 bp和560 bp两条片段，将两个PEPCK启动子片段插入pGL4.26－Luc2报告质粒中，将重组质粒转染到肝脏细胞系和脂肪细胞系，以非脂肪或肝脏细胞系做对照，比较PEPCK驱动荧光素酶表达效率。结果通过酶切鉴定及基因测序，证明pGL4.26－PEPCK－Luc2荧光素酶表达质粒构建成功，且能够在体外表达荧光素酶。结论两种同片段的PEPCK启动子在各细胞系中的表达效率差异无显著性。

重组质粒;表达效率;磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK)能催化草酰乙酸(oxaloacetate，OAA)转化为磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)，是体内糖异生作用中第一个关键酶，其调节主要在转录及转录后水平。PEPCK基因在肝、肾、褐色脂肪和白色脂肪中高表达［1］。其表达受多种激素和第二信使的转录水平调节，其中包括胰岛素、糖皮质激素、维甲酸、甲状腺素、环磷脂酸腺苷［2］。PEPCK基因转录的组织特异性是由激素和饮食调控的。例如:PEPCK在肝脏中的表达和血糖浓度有关，在肾脏中的表达主要受体质的酸/碱比例调控。在肝脏和肾脏中，糖皮质激素刺激其表达，而环磷酸腺苷和胰岛素抑制其表达。在脂肪组织中，糖皮质激素则抑制其表达。

转录调控的复杂性使PEPCK基因成为研究激素相关和基因表达组织特异性的有力模型，目前国际上已经研究出包括PEPCK启动子区域－888～+ 69序列构建的载体可以在肝、肾和小肠中特异性表达并且受激素和饮食的调控。然而PEPCK启动子区域在脂肪组织中特异性表达的报道则极少，Jerry等在1999年利用转基因小鼠证明PEPCK启动子区域－1242～828为脂肪特异的增强子，这个增强子可作为PEPCK在脂肪中特异表达的启动子［3］。所以我们选定PEPCK启动子区域－1254～+69作为在脂肪中的特异表达启动子，采用荧光素酶表达系统，构建PEPCK－1254～+69启动子调控的荧光素酶表达质粒，同时构建PEPCK－488～+69核心启动子区域调控的荧光素酶表达质粒作为对照［4］。将构建好的载体转染到肝脏细胞系和脂肪细胞系，以非脂肪或肝脏细胞系做对照，比较PEPCK驱动荧光素酶表达效率。

1 材料和方法

1.1 细胞株和载体

BRL－3A大鼠肝细胞株、3T3－L1脂肪前体细胞株购于中科院生化细胞所。HEK－293细胞株、SHSY5Y细胞株BMC细胞株、pGL4.26－Luc2(连接荧光素酶报告基因Luciferase)、PCDNA3.1－Luc2为华东师范大学脑功能基因组研究所保存。pMD18－T载体购于TaKaRa公司。

1.2 主要试剂

本实验克隆所用的内切酶、T4连接酶、高保真Taq酶、Trizol、RT－PCR试剂盒均购自TaKaRa公司; M1640培养基、DMEM培养基、MEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司;Lipofectin2000购自Invitrogen公司;荧光素酶测定试剂盒购自Promega公司。

1.3 pGL4.26-PEPCK-Luc2载体的构建

以大鼠基因组DNA为模版，在PEPCK启动子－488～+69设计引物:

同时在PEPCK启动子－1254～+69设计引物:

经PCR扩增，回收产物大小为560 bp和1323 bp的片段，回收PCR产物链接到pMD18－T载体中，测序。利用pMD－18T载体上Kpn I位点和PEPCK启动子3′端Bgl II位点进行双酶切，同时用上述两个酶双切pGL4.26，酶切产物回收、链接、转化、克隆筛选得到pGL4.26－PEPCK－Luc2载体。

1.4 pGL4.26-PEPCK-Luc2载体荧光素酶表达活性的鉴定

用脂质体转染法将重组质粒pGL4.26－PEPCKLuc2分别转染BRL－3A、3T3－L1、SHSY5Y、293、MBMC细胞株。为了验证脂质体转染的最佳转染效率，脂质体与质粒的比例分别为1∶0.5、1∶2.5和1∶5。具体步骤为:①将密度为2.5×105的细胞接种到96孔板，待细胞融合到90%～95%。②25 μL Opti－MEM分别稀释质粒和0.4 μL的脂质体，室温放置5 min。③稀释好的脂质体和质粒混匀，室温放置20 min。④混合液加入到含100 μL Opti－MEM培养基的细胞孔中于37℃、5%CO2条件下培养6 h后换含血清的培养液继续培养24 h。

1.5 荧光素酶活性的测定

转染24 h后，各细胞孔加100 μL荧光素酶裂解液，以含有CMV启动子的PCDNA－Luc2做为荧光素酶表达效率对照，三种比例的的转染液比较转染效率，在酶标仪上测定荧光素酶的活性。所有的实验数据都取4个样品的平均值，每个实验重复2次。

2 结果

2.1 PEPCK启动子PCR扩增结果

由PCR扩增产物电泳图可以看出，两对引物分别在预期的560 bp和1323 bp处出现明显DNA片段(图1)，无明显非特异性条带。PEPCK启动子与pMD18－T载体连接，连接产物经DH5a转化之后，克隆后经酶切鉴定条带与预计条带大小相符，测序结果经Blast对比与大鼠PEPCK基因序列完全相符。

2.2 含PEPCK启动子荧光素酶报告基因质粒的酶切鉴定及测序

1:长片段PEPCK PCR产物;3、4:短片段PEPCK PCR产物;M:DL2000 marker;2、5:空白对照图1长、短两个段片段PEPCK扩增结果Note:1:PEPCK－long fragment product;2，4:PEPCK－short fragment product;M:DL2000 marker;2，5: Negative controlFig.1 The results of PCR amplification of the genom ic DNA of PEPCK long and short fragments

重组质粒经转化后挑取克隆经过酶切鉴定(图2)。测序结果经Blast对比证实完全正确。说明含PEPCK启动子荧光素酶报告基因质粒构建成功。

1:长片段的PEPCK重组质粒;2:短片段的PEPCK重组质粒;3: Kpn I+Bgl II酶切pGL4－PEPCK－short;5:Kpn I+Bg lII酶切pGL4－PEPCK－long;M:DL2000 marker;4、6:空白对照图2两种pGL4－PEPCK－Luc2质粒的酶切鉴定Note:1:pGL4－PEPCK－long;2:pGL4－PEPCK－short;M:DNA maker (DL2000);3:pGL4－PEPCK－short digested with Kpn I+Bgl II;5: pGL4－PEPCK－long digested with Kpn I+Bgl II;4，6:Negative control.Fig.2 Identification of the recombinant pGL4－PEPCK－long and pGL4－PEPCK－short by restriction enzyme digestion

2.3 转染细胞转染效率和荧光素酶活性的测定

重组质粒pGL4－PEPCK－Luc2分别瞬时转染脂肪前体细胞系3T3－L1和大鼠肝细胞系BRL－3A，用非脂肪细胞和非肝脏细胞系SHSY5Y、293、MBMC细胞系作为对照，比较PEPCK驱动荧光素酶表达效率。以强启动子CMV作为PEPCK启动子效率表达的对照组，为了验证脂质体转染的最佳转染效率，脂质体与质粒的比例分别为1∶0.5、1∶2.5和1∶5。结果CMV启动子的转染效率在各种细胞系都是脂质体与质粒比例为1∶2.5时最高。长、短两个片段的PEPCK启动子在BRL－3A、3T3－L1和MBMC细胞系中在1∶2.5时转染效率最高，在其他两个细胞系中以1∶0.5时转染效率最高。从图3可以看出，以CMV为对照的两个PEPCK启动子表达效率，在肝细胞系BRL－3A中表达效率最高，在HEK－293细胞系中表达最低。短片段的PEPCK启动子在各细胞系中表达都比长片段的表达效率要高，只有在HEK－293细胞系中长片段表达效率高于短片段启动子，且存在显著性差异。

图3 不同PEPCK启动子转染各细胞系后表达效率比较(%)Fig.3 Comparison of the expression efficiency in different cell lines after pGL4－PEPCK－long and pGL4－PEPCK－short transfection.*P＜0.05: compared with pCMV－luc2

3 讨论

对于PEPCK基因启动子区域的转录调节因子，国内外已经做了很细致的研究，在PEPCK启动子－1000～+1区域可分为四个功能区［5］:区域一包括TATA盒、CAAT盒区域和环磷酸腺苷调节元件(CRE)的启动子区域。区域二包括肝细胞核因子－1 (HNF－1)结合位点、CAAT/增强子结合蛋白(C/ EBP)结合区域和甲状腺素调节元件(TRE);区域三由一个皮质激素调节单位(GRU)组成，包括两个糖皮质激素调节(GRE)元件，一个胰岛素调节元件(IRE)，一个维甲酸受体(RARE)结合区域和两个肝细胞核因子(HNF)3辅助因子(AF)结合区域;区域四一直延伸到启动子区域－1000包括两个过氧化物酶激活受体γ2(PPARγ2)结合位点在－451～－439和－999～－987区域。后者的结合位点是PEPCK基因在脂肪组织中特异性表达结合位点［6］。

目前研究PEPCK基因多借助灵敏度及重复性较好的荧光素酶报告系统取代以同位素作为测定标识、检测时间长、分析灵敏度不高的氯霉素乙酰转移酶报告系统［7］。本研究通过对重组pGL4.26－PEPCK－Luc2酶切鉴定、测序鉴定以及在细胞内瞬时表达表明成功构建PEPCK两个不同启动子片段的荧光素酶表达质粒。其中PEPCK基因的调控元件多位于560 bp短片段启动子区域，为PEPCK基因的核心启动子区域，长片段的启动子区域在此基础上延伸到－1254 bp，包含两个过氧化物酶激活受体γ2((PPARγ2)结合位点，而这两个位点是正是PEPCK基因在脂肪组织中特异性表达结合位点［6］。将这两个质粒用脂质体瞬时转染肝细胞系BRL－3A和脂肪前体细胞系3T3－L1，用非脂肪和非肝脏细胞系SHSY5Y、HEK－293、MBMC作为对照。在肝脏细胞系BRL－3A中，两个PEPCK启动子片段的表达效率高于其他细胞系。长、短两个片段的PEPCK启动子区域在脂肪前体细胞系3T3－L1系中表达效率没有显著性差异。在各种细胞系中560 bp短片段启动子区域要比1336 bp长片段启动子区域表达稍高，但没有显著性差异。说明在调控过程中是－488～+69约560 bp的短片段启动子其主要调控作用，并且有文献报道PEPCK启动子调控载体在各组织的特异性表达受饮食和激素的调控，这也可能是表达效率没有显著性差异的原因之一。不过在HEK－293细胞系中长片段启动子区域表达高于短片段，且有显著性差异。同时鉴定脂质体转染法不同比例下的转染效率得出长、短两个片段的PEPCK启动子在BRL－3A、3T3－L1和MBMC细胞系中在1∶2.5时转染效率最高，在其他两个细胞系中以1∶0.5转染效率最高，实验结果差异可能与细胞系、培养条件及细胞状态的不同有关。

目前国际上对PEPCK启动子在肝脏、肾、小肠中特异性表达有了详尽的报道，而在脂肪组织中特异性表达的PEPCK启动子序列的报道很少。对于在脂肪组织中特异表达的PEPCK启动子区域还不确定，Eisenberger等［8］在1992年将大鼠PEPCK基因5′端2.2 kb的序列转入小鼠，发现在－2086～ 888这段序列在脂肪组织中表达。Jerry等在1999年利用转基因小鼠证明PEPCK启动子区域－1242～828为脂肪特异的增强子［3］。本研究就是选定PEPCK启动子的－1254～+69区域1 336 bp和－488～+69区域约560 bp的调控序列，采用荧光素酶报告系统比较PEPCK不同启动子调控报告基因表达效率，实验证明PEPCK启动子的－1254～+69和－488～+69这两段序列可调控报告基因表达，但表达效率没有显著性差异。

［1］JD.Horton，I.Shimomura，MS.Brown，et al.Activation of cholesterol synthesis in preference to fatty acid synthesis in liver and adipose tissue of transgenic mice overproducing sterol regulatory element－binding protein－2［J］.J Clin Invest，1998，101:2331－2339.

［2］Giralt M，Park EA，Gurney AL.Identification of a thyroid hormone response element in the phosphoenolpyruvate carboxykinase(GTP)gene.Evidence for synergistic interaction between thyroid hormone and cAMP cis－regulatory elements［J］. Biol Chem，1991，266:21991－21996.

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Com parison of the Expression Efficiency of Two Different Recom binant Firefly Luciferase Reporter Plasm ids pGL4-PEPCK-Luc2

WANG Xue－bin1，FENG Jie2，YANG Yu－qin3，XIE Jian－yun2，CHEN Guo－hong1
(1.College of Animal Science and Technology，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China; 2.Shanghai Quality Monitoring Center of Laboratory Animals，Shanghai Laboratory Animal Research Center，Shanghai 201203，China;3.Fudan University，Shanghai 200032，China)

ObjectiveTo construct two different luciferase reporter p lasmid pGL4.26－PEPCK－Luc2，and to evaluate the expression efficiency of the phosphoenolpyruvate carboxykinase(PEPCK)gene promoters in several cell lines in vitro.M ethods Two PEPCK promoter fragments 1323 bp and 560 bp were obtained from rat genomic DNA by PCR，and the fragments were inserted in pGL4.26－Luc2 luciferase reporter plasmid.Then the recombinant plasmid was transfected into hepatoma and adipocyte cell lines to compare the PEPCK driven luciferase expression efficiency.Results

Restriction enzyme digestion and nucleotide sequencing conformed that the coupling site of the recombinant was correct without base mutation and deletion.The luciferase was expressed in the cell lines transfected with different plasmids pGL4. 26－PEPCK－Luc2.ConlusionThe expression efficiency of the two different PEPCK promoters in various cell lines has no significant difference.

Recombinant plasmid;Expression efficiency;Phosphoenolpyruvate carboxykinase

R349.64

A

1005－4847(2010)03－0225－04

2009－09－18

综述·进展

上海市科学基因资助项目(071409001)。

王学斌(1985－)，男，硕士，研究方向，特种经济动物饲养。E－mail:mars8001)558@126.com

谢建云(1968－)，女，研究员，主要从事实验动物遗传学研究。E－mail:xiejianyun@hotmail.com