猕猴血清B病毒抗体三种检测方法的比较

杨丽芬,周亚敏,李绍东,唐品超,吴志蕾,王 琼

(中国实验动物云南灵长类中心,昆明 650216)

技术方法

猕猴血清B病毒抗体三种检测方法的比较

杨丽芬,周亚敏,李绍东,唐品超,吴志蕾,王 琼

(中国实验动物云南灵长类中心,昆明 650216)

目的对B病毒 (B virus)抗体检测的 3种方法进行比较,寻求准确、可靠、经济的检疫方法。方法对以 HSV-1为抗原的玻片酶免疫法、B病毒为抗原的玻片酶法(E IA)和酶联免疫吸附法 (EL ISA)的猕猴血清B病毒抗体检测结果进行比较。结果HSV-1为抗原的 E IA与 B病毒为抗原的 E IA、EL ISA检测结果符合率分别为97.7%和 95.5%。结论HSV-1为抗原 E IA的检测结果与B病毒抗原 E IA和 EL ISA的检测结果一致性较好,可以做为初筛手段,且检测效果较好,投入资金相对最低,达到节约成本的目的。

猕猴;B病毒;抗体检测

猴 B病毒属于疱疹病毒科 (Herpetoviridae),甲型疱疹病毒亚科(Cercopithecine herpesvirus1)疱疹病毒属(Herpesvirus),猕猴疱疹病毒(Herpesvirus sim iae)(B virus)[1]。猕猴是B病毒的自然宿主,又是医学科学研究中的重要实验动物。人类感染猴B病毒表现为脑脊髓炎症状,目前医疗条件下,患者死亡率高[2]。因此要使用猕猴做实验动物,首先要求是B病毒阴性。检测B病毒相关抗体是建立无B病毒感染 SPF猴群的基础。人单纯疱疹病毒(HSV-1、HSV-2)、与 SA8病毒 (见于非洲绿猴和狒狒的一种疱疹病毒)具有密切的抗原关系[3]。可采用HSV-1作抗原,检测实验动物群中的 B病毒相关抗体[4]。

本文报道了用 HSV-1抗原建立的玻片酶免疫法(E IA)与B病毒为抗原的玻片酶免疫法 (E IA)及酶免疫吸附法 (EL ISA),对人工饲养猕猴血清 B病毒的检测结果进行比较,认为 HSV-1抗原建立的玻片酶免疫法(E IA)可以作为廉价的初筛手段。

1 材料和方法

1.1 血清样品

来源于中国实验动物云南灵长类中心人工饲养的猕猴,静脉采血,2500 r/min离心 30 min后,分离血清、-30℃保存、备用。

1.2 方法

1.2.1 HSV-1玻片酶免疫法(E IA):用 HSV-1病毒株接种Vero细胞,在细胞出现病变时收获并制成抗原片,建立起 E IA。HSV-1毒株来源于北京生物制品检定所,Vero细胞引自中国科学院实验动物研究所,羊抗猴 IgG酶结合物购自美国 Organon Teknika公司。血清稀释度为 1∶5。

1.2.2 BVB玻片酶免疫法(E IA):BV抗原片(由军事医学科学院实验动物中心,田克恭提供),HRPSPA工作浓度 1∶150,血清稀释度 1∶5。

1.2.3 BV酶联免疫吸附法 (EL ISA):由日本公司用B病毒抗原的 EL ISA试剂盒对我们用 HSV-1抗原 E IA方法的检测结果进行符合检测。

2 结果

2.1 BVEIA与 HSV-1EI A法结果比较

用 HSV-1E IA法检测为阳性的 37份样品,经BVE IA法检测全部为阳性,而经 HSV-1检测为阴性的 50份样品,经BVE IA法检测 48份为阴性,2份为阳性。与 HSV-1E IA法相比,BVE IA法检测阳性率为 44.8%,HSV-1E IA法检测阳性率为 42.5%,两者的符合率为 97.7%(表 1)。

表 1 两种抗原的检测结果比较Tab.1 Comparison of results of two antigens tests

2.2 HSV-1和 BVEL ISA的检测结果的比较

用 HSV-1E IA方法检测的 464份阴性血清样本经日本公司用BV抗的 EL ISA试剂盒检测 464份阴性血清中 443份仍为阴性,21份为阳性 (4.5%)符合率为 95.5%(表 2)。

表 2 E IA法和 EL ISA法的检测结果比较Tab.2 Comparison of results of E IA be tween EL ISA tests

3 讨论

国内众多学者对B病毒检测方法进行过研究。吴小闲等[4]以 HSV-1为抗原,以中和试验为基础,建立了 E IA和 EL ISA法,并进行了比较研究。在所检 84份血清中,中和试验和 EL ISA检测相符者 75份,符合率 89.3%;中和试验和 E IA检测相符者 73份,符合率 86.9%。EL ISA和 E IA同是免疫酶技术,二者比较两种方法相符者 78份,符合率93.3%。结果表明两种方法均可应用于实际。就此以后,国内各相关实验室开展了技术引进和创新,建立了各自的 E IA方法并广泛应用于科研和生产实践中,取得了较好的社会效益和经济效益。王欣等[5]比较了用 HSV-1(E IA法)和 B病毒 (D IA试剂盒)检查猴B病毒相关抗体和 B病毒抗体的结果: E IA法检查出的B病毒相关抗体阴性猴,经 D IA试剂盒检查有 99%的符合率,表明 E IA的结果与D IA试剂盒有较好的一致性。田克恭等[6]用 HSV-1E IA法和B病毒 D IA法同时检测了 60份猴血清,结果前者阳性率 5%,后者为 10%,其中经 E IA法检测为阳性的 3份猴血清,经 D IA法检测均为阳性,而经E IA法检测为阴性的 57份猴血清中,经 D IA法检测3份为阳性。二者的符合率 95%。笔者用 HSV-1E IA法检测为阳性的 37份样品,经BVE IA法检测全部为阳性,而经 HSV-1检测为阴性的 50份样品,经BVE IA法检测 48份为阴性,2份为阳性。与HSV-1E IA法相比,BVE IA法检测阳性率为 44.8%, HSV-1E IA法检测阳性率为 42.5%,两者的符合率为 97.7%.由此可看出,自吴小闲等开创研究工作后,不同的单位与人员所做的类似试验共同的结果是:用相同的血清样本在同一实验室,以不同的方法、不同的抗原进行检测,结果的符合率都达 95%以上。

王晓明等[7]采用以人单纯疱疹病毒 (HSV-1)为抗原的 EL ISA法和酶免疫法 E IA在国内 70份血清进行检测,结果 B病毒相关抗体为阴性。相同血清在国外测得 B病毒抗体阳性者有 7份,检测结果的符合率为 90%。结果表明以 HSV-1为抗原不能检出全部B病毒感染动物。周亚敏等[8]以人单纯疱疹病毒 HSV-1为抗原的 E IA法和 B病毒为抗原的EL ISA法,检测结果的符合率为 97.4%;在 HSV-1为抗原的 E IA检测确定的 779份阴性血清中,经 B病毒抗原的 EL ISA检测,有 2.6%(20)为阳性; HSV-1为抗原的 E IA和 HSV-1为抗原 EL ISA检测均为阴性 20份血清样本,经 B病毒抗原的 EL ISA检测,18份仍为检出阴性,2份为阳性。检测结果的符合率为 90%。作者用HSV-1E IA方法检测的四批共 464份阴性血清样本经日本公司用BV为抗原的EL ISA试剂盒检测 464份阴性血清中 443份仍为阴性,21份为阳性。符合率为 95.5%。总体看检测结果大部分是相同的,但可看出,相同的血清样本、不同的抗原、不同的方法、不同的实验室检测结果有一定差异,可能是各实验室自行制备的 HSV-1抗原片及制定的检测条件有差异。

作者用 HSV-1作抗原的玻片免疫酶法(E IA)对实验动物群进行初筛后将阴性实验动物提供给不同国家的用户,据 2003年以前不完全统计的数据有七批次 588只,经用户进行符合检测,结果均得到认可。可以说明用人单纯疱疹病毒(HSV-1)抗原代替以B病毒(BV)抗原建立的方法对实验动物进行初筛是有效的、可靠的。

随着实验动物学科的发展与人们的社会需求,必须清醒地认识到:由于 B病毒对人的危害性极大,因此实验用猕猴的 B病毒检测工作越来越重要,建立无 B病毒的实验动物群势在必行。在人工饲养的条件下,用 HSV-1作抗原的玻片免疫酶法(E IA)对实验动物群进行初筛,以建立无 B病毒实验动物群是有较好的积极作用。但是由于方法之间存在差异;HSV-1与B病毒在抗原上客观存在的差异;各个实验室的检测条件存在差异,所以存在漏检的情况。所以,要建立无 B病毒的 SPF实验动物群建议先用 HSV-1E IA法进行 30 d、90 d、180 d反复检测,每次检测出的阳性实验动物都将其及时隔离,初步建立阴性群,再用 B病毒抗原的方法进行确认。以后每年进行定期的复检,隔离阳性实验动物。与此同时,加强饲养管理,对阴性实验动物群必须建专属隔离饲养区、专人负责,饲养工具、清洁卫生工具专用,严格的消毒措施,保证年检阳性率低于 5%。因此,HSV-1作抗原的玻片免疫酶法(E IA)用在建立无 B病毒的实验动物群工作上,不但可以提高效率,而且因其应用价廉,频率高,其降低成本效果更显著。

[1] Benjamin J,Weigler BJ.Biology of B virus in Macaque and human hosts:A Review[J].ClinInfect Dis,1992,14(2):555 -567.

[2] 田克恭.实验动物病毒性疾病[M].北京:农业出版社,1992, 373-380.

[3] 蔺会云,遇秀玲,田克恭.猴 B病毒研究进展[J].实验动物科学与管理,2000,17(2):38-44.

[4] 吴小闲,蒋虹,曲立荣,等.恒河猴 B病毒相关抗体检测方法的比较[J].病毒学杂志,1989,1:80.

[5] 王欣,魏强,佟巍,等.B病毒血清学方法比较初探[J].中国实验动物学杂志,1996,6(4):216-217.

[6] 田克恭,贾锐胜,李俊梅,等.两种抗原不同方法检测猕猴 B病毒抗体的初步探讨[J].实验动物与管理,1998,15(1):26.

[7] 王晓明,邵伟娟,王建飞.猴 B病毒抗体及 B病毒相关抗体EL ISA检测结果比较 [J].上海实验动物科学,1997,17 (2):80.

[8] 周亚敏,李绍东,杨森富,等.猴疱疹病毒(B病毒)抗体检测方法的比较研究 [J].中国比较医学杂志,2005,15(4)237 -239.

Comparison of ThreeM ethods for Detecting B Virus Antibodies in Macaque M onkey

YANGLi-fen,ZHOU Ya-min,L I Shao-dong,TANG Pin-chao,WU Zhi-lei,WANGQiong
(Yunnan Nation Laboratory Primate Center of China,Kunming 650216,China)

ObjectiveTo compare three detections for B virus antibodies,and to find an accurate,reliable and economicalmethod。MethodsB virus antibodieswere detected with enzyme immunoassay(E IA,HSV-1 antigen),enzyme immunoassay(E IA,B virus antigen)and enzyme-linked immunosorbent assay(EL ISA,B virus antigen)in macaque sera, and the testing resultswere compared。ResultsConsistency of testing results of E IA(HSV-1 antigen)with E IA(B virus antigen)and EL ISA(B virus antigen)were 97.7%and 95.5%。ConclusionThere ismuch consistencyof testing results of E IA(HSV-1 antigen)with E IA(B virus antigen)and EL ISA(B virus antigen),it can be used to do primary detection, and itwill be reduced the cost.

Macaque;B virus;Antibody detection

Q959.848

B

1671-7856(2010)03-0061-03

2009-11-11

杨丽芬(1964-),女,中职,研究方向:实验动物学。E-mail:okylf@163.com