高脂饮食加低剂量链脲霉素建立小鼠 2型糖尿病模型

姜 骊,陈 辉,何 勇,鱼 达

(浙江大学医学院附属第一医院卫生部多器官联合移植研究重点实验室,浙江省器官移植重点实验室,杭州 310003)

研究报告

高脂饮食加低剂量链脲霉素建立小鼠 2型糖尿病模型

姜 骊,陈 辉,何 勇,鱼 达

(浙江大学医学院附属第一医院卫生部多器官联合移植研究重点实验室,浙江省器官移植重点实验室,杭州 310003)

目的高脂饮食加低剂量链脲霉素 (Streptozotocin,STZ)建立小鼠 2型糖尿病模型。方法5周的雄性C57BL/6J小鼠,随机分为正常饲料组、正常饲料加 STZ组、高脂饲料组和高脂饲料加 STZ组。相应饲料喂养5周后,按照 100 mg/Kg的剂量腹腔注射 STZ,然后继续喂养 4周。在第 5周和第 9周末测定小鼠的体重、收缩压、血糖、血胰岛素、血甘油三脂和胆固醇水平。结果STZ注射前各组小鼠的体重、血压、血糖、血胰岛素、血脂和血甘油三脂无明显差异(P>0.05)。STZ注射后 4周时,高脂饲料加 STZ组小鼠的体重、血糖、血胰岛素、血压和血脂水平明显升高(P<0.05);而其他三组的这些指标无明显改变或仅部分升高。结论高脂饮食加低剂量链脲霉素可建立小鼠 2型糖尿病模型,该模型具有人 2型糖尿病的主要表型特征和相似的发病过程。

2型糖尿病;模型,动物;C57BL/6J小鼠;链脲霉素;高脂饮食

2型糖尿病动物模型中应用较多的有遗传因素占主导作用的动物,如 ob/ob小鼠,基因剔除小鼠[1,2]。采用链脲霉素 (Streptozotocin,STZ)诱导注射或反复诱导的方法[2],经 STZ注射后,胰岛β细胞破坏及功能受损严重,获得的模型接近于 1型糖尿病。因此,建立啮齿类动物 2型糖尿病模型的方法有必要改进,国内对大鼠 2型糖尿病模型的研究比较深入。本研究目的采用高脂饮食加小剂量链脲霉素的方法,建立一种经济、操作简便和类似于人普通 2型糖尿病的小鼠模型,探讨并论证其表型特征,为今后的胰岛功能康复研究进行必要的准备。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

STZ购于 Sigma公司,胰岛素放免试剂盒购于北京科美东雅生物技术有限公司,胆固醇和甘油三脂试剂盒购于南京建成生物工程公司。血糖仪和血糖试纸条为美国强生公司 OneTouch SureStep系列产品。柠檬酸和柠檬酸三钠购于上海生物工程有限公司。BP-6无创血压测试仪购于成都泰盟科技有限公司。

1.2 实验动物

雄性 C57BL/6J小鼠,4周龄,体重 14～16 g,购于中国科学院上海实验动物中心[SCXK(沪)2007-0005]。小鼠饲养在浙江大学医学院附属第一医院实验动物中心,室温保持在 20℃～25℃,湿度 55%左右。动物自由进食、进水,每天保持 12 h的昼夜循环。开始实验前动物适应环境 1周。所有实验操作符合科技部和浙江大学医学院附属第一医院实验管理委员会的要求。应用随机数字表法将小鼠随机分为正常饲料组(n=8),正常饲料加 STZ组(n =8)、高脂饲料组(n=8)和高脂饲料加 STZ组(n= 8)。

1.3 高脂饲料

参 照 Researcher Diets 公 司 (www. ResearcherDiets.com)的高脂饲料配方,由中国科学院上海实验动物中心制作脂肪含量为 45%的高脂饲料,具体配方见表 1。

表 1 高脂饲料各组份的用量和所占成分比,能量和热卡百分比值Tab.1 Components of high fat food,percentage of the parts and of the energy and calories

1.4 糖尿病小鼠模型建立

小鼠分别给予相应饲料喂养 5周,在第 5周末,禁食 8 h。取 200 mg STZ溶于 5 mL的 0.1 mol/L柠檬酸缓冲液中,按照 100 mg/Kg的剂量腹腔注射。STZ注射的整个操作在冰浴上进行,保证整个注射过程在 15 min内完成。正常饲料和高脂饲料组小鼠按照 100 mg/Kg腹腔注射 0.1 mol/L柠檬酸缓冲液。注射后继续各自的饲料喂养 4周,在第 9周末,小鼠禁食 8 h后,用灭菌小剪刀剪尾取血,应用血糖仪测定血糖,血糖≥16.7 mmol/L被认为糖尿病模型成功。饲养过程中保证充足的水和食物,并每天更换鼠笼和垫料一次。

1.5 收缩压的测定

使用BP-6无创血压计,采用尾袖法测量小鼠安静清醒条件下尾动脉收缩压。将小鼠在 36℃环境中预热 5 min后,固定于舒适位置,加压袖口安置于小鼠尾根部,充气加压使之超过收缩压 30 mmHg (压力达到收缩压水平时脉搏搏动消失,据此判断),然后缓慢减压,经压力换能器和放大器连接于Medlab生物机能实验系统记录血压。每只小鼠连续测量 3次,间隔 60 s,取其平均值。

1.6 血糖,血胰岛素,胆固醇和甘油三脂和的测定

血糖的测定使用美国强生公司 OneTouch SureStep产品,测定胰岛素使用北京科美东雅生物技术有限公司的胰岛素放免试剂盒,测定胆固醇和甘油三脂水平的测定使用南京建成生物工程公司的试剂盒。经小鼠的眼内眦静脉取血 4滴,静置 30 min后,4℃1000 g离心 10 min分离血清,再按照试剂盒的说明书进行操作。其中,胰岛素应用GAMMA C12全自动γ-计数仪检测,胆固醇和甘油三脂应用日立 7600全自动生化分析仪检测。

1.7 统计分析

2 结果

实验组和对照组小鼠在体重、血糖、血胰岛素、收缩压、胆固醇、甘油三酯水平的对比情况见表 2。其中,STZ注射前各组小鼠体重无明显差异 (P> 0.05)。在 STZ注射后 4周时,高脂饲料组和高脂饲料加 STZ组的体重较正常饲料和正常饲料加 STZ组明显升高(P<0.05),但两组之间无明显差异 (P >0.05)。STZ注射前各组血糖和血胰岛素之间无明显差异(P>0.05)。在 STZ注射后 4周时,高脂饲料加 STZ组的血糖和血胰岛素较其它三组明显升高 (P<0.05);但正常饲料、正常饲料加 STZ和高脂饲料组之间血糖和血胰岛素无明显差异 (P> 0.05)。其中,STZ注射前各组小鼠收缩压、血胆固醇和甘油三脂之间无明显差异 (P>0.05)。在 STZ注射后4周时,高脂饲料加 STZ组的收缩压、血胆固醇和甘油三脂之间较其它三组明显升高 (P< 0.05)。正常饲料对照、正常饲料加 STZ和高脂饲料对照组之间收缩压、血胆固醇和甘油三脂无明显差异(P>0.05)。

表 2 实验组与对照组体重、收缩压、血糖、血胰岛素、血胆固醇和甘油三脂水平比较 (±s)Tab.2 Comparison of bodyweight,systolic pressure,glucose value,insulin,cholesterin and triglycerides in rats of the experimental and control groups(±s)

表 2 实验组与对照组体重、收缩压、血糖、血胰岛素、血胆固醇和甘油三脂水平比较 (±s)Tab.2 Comparison of bodyweight,systolic pressure,glucose value,insulin,cholesterin and triglycerides in rats of the experimental and control groups(±s)

注:高脂饲料组和高脂饲料加 STZ组与其他组相比在体重和血胰岛素 2个指标上,＊P<0.05;高脂饲料加 STZ组与其他组相比在血糖水平上,＊P<0.05;高脂饲料加 STZ组与其它组相比在收缩压、血胆固醇、甘油三脂,＊P<0.05。Note:The groups of high fat diet and itwith STZwere significant differences comparingwith other groups in bodyweight and insulin level,＊P<0.05; High fat dietwith STZwas significant differences to other groups in glucose value,＊P<0.05;Fat diet with STZ was significant differences comparing with other groups in systolic pressure,cholesterin and triglycerides,＊P<0.05.

组别 Group体重Bodyweight收缩压Systolic pressure血糖Glu Value胰岛素Insulin血胆固醇Cholesterin甘油三脂Triglycerides STZ前,STZ后Before,4 week STZ前,STZ后Before,4 week STZ前,STZ后Before,4 week STZ前,STZ后Before,4 week STZ前,STZ后Before,4 week STZ前,STZ后Before,4 week正常饲料组 Normal feed 20.4±3.2, 25.4±4.2 100±5.2, 106±6.1 5.6±0.7, 6.4±0.4 15.0±2.1, 15.8±3.1 1.35±0.21, 1.45±0.23 156±0.36, 1.62±0.30高脂饲料组 High fat food 24.6±3.6, 31.5±4.7＊106±5.3, 110±6.5 5.7±0.6, 8.9±0.9 14.0±2.7, 17.6±3.8＊1.60±0.45, 1.70±0.28 1.60±0.51, 1.82±0.33正常饲料 +STZ Normal feed+STZ 19.1±2.3, 22.4±2.8 103±7.0, 104±5.8 5.1±0.3, 9.6±1.0 14.7±3.4, 13.5±2.6 1.30±0.41, 1.36±0.12 1.51±0.33, 1.59±0.24高脂饲料 +STZ High fat food+STZ 23.4±4.1, 29.0±3.3＊102±5.8, 130±7.2 6.2±0.7, 15.5±2.6＊15.2±3.4, 18.9±4.1＊1.59±0.33, 2.35±0.35 1.65±0.37, 5.40±0.46

3 讨论

2型糖尿病的病因非常复杂,涉及到各种遗传因素和环境因素以及它们间的相互作用,其主要发病机制为胰岛素抵抗合并相对性分泌不足[3～6]。发生 2型糖尿病时多表现为高胰岛素血症、高血糖和肥胖,并伴有高血压、高脂血症和高胆固醇血症。本研究中显示高脂饲料加低剂量 STZ组小鼠在第 9周时血糖、血胰岛素、血压、体重、血甘油三脂和胆固醇均明显升高,这些症状与人 2型糖尿病临床表现相似。

高脂饲料是一种常用的建立胰岛素抵抗和肥胖的方法,根据脂肪含量的高低和 STZ的用量和次数的差异,可产生不同的特征,建立不同的类型。本实验方案是经过预试的,在研究中使用的是动物喜食的脂肪含量为 45%的高脂饲料,该饲料具有很高的诱导胰岛素抵抗和肥胖的成功率[7～9]。我们的研究结果与国内外的结果在主要表型特征和发病过程方面较一致。值得注意的是 STZ的诱导剂量与动物品系关系密切,预试和正式实验必需采用同一品系的动物,方可使用相同的诱导方案。从这个意义上而论,预试是建立 2型糖尿病动物模型所经常必需的。

STZ为 StreachromogenesUar.128产生的亚硝脲类抗生素,可自行分解活泼的甲基正碳离子,与DNA呈链间交叉连结,从而使DNA烷化;也可在体内可形成异氰酸盐,从而与核酸蛋白结合,抑制DNA多聚酶活力,使受损的 DNA难于修复。其致糖尿病机制主要是由于胰岛细胞中菸酰胺腺嘌呤(DNA)含量减少,STZ分子中的葡萄糖基可使 STZ进入胰岛β细胞,引起β细胞核内形态变化,使其染色体凝集、伸长和浓缩。小鼠对 STZ有一定的耐受性,研究显示注射 150 mg/Kg或者更大剂量可以引起明显的胰岛β细胞受损,使血糖明显升高,这种方法诱导迅速建立的是 1型糖尿病模型[10,11]。在本研究中使用 100 mg/Kg的 STZ可以使胰岛β细胞发生轻度的受损,使血糖较注射前轻度升高。但是在高脂饲料的导致胰岛素抵抗的基础上,受损的胰岛β细胞不足以维持正常的血糖稳态,致使血糖显著升高。

本研究显示高脂饲料喂养 5周后,给予小剂量的 STZ继续喂养 4周可以使小鼠的血压、体重、血糖、血胰岛素、血甘油三脂和胆固醇明显升高,符合人 2型糖尿病的发病机制和临床特点,而且操作简便、价格便宜,具有人 2型糖尿病的主要表型特征和相似的发病过程。这说明高脂饲料联合低剂量 STZ是一种理想的建立 2型糖尿病模型的方法,可为研究 2型糖尿病的发病机制,治疗方法和研究胰岛移植等提供重要的实验基础。

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M odel Establishment of Type 2 D iabetesM ellitus Induced by High FatD iet with Low Dose Streptozotocin in C57BL/6JM ice

J IANGLi,CHEN Hui,HE Yong,YU Da
(KeyLaboratory ofMulti-Organ Transplantation,Ministry of Health,the FirstAffiliated Hospital,ZhejiangUniversity School ofMedicine;Zhejing Province KeyLaboratory ofOrgan Transplantation,Hangzhou 310003,China)

ObjectiveTo develop a mice model of type 2 diabetesmellitus(DM)by high fat dietwith low dose streptozotocin(STZ)。MethodsMale C57BL/6J mice at5 weeksof agewere randomly divide into conventional diet(n= 8),conventional dietwith STZ(n=8),high fat diet(n=8)and high fat diet with STZ group(n=8).After the exposure to conventional or high fat diet for 5 weeks,mice were injected intraperitoneallywith 100 mg/kg of either STZ or vehicle solution during fasting state,and kepton the same diet for the next 4 weeks.Bodyweight,systolic blood pressure, blood glucose,serum insulin,serum cholesterol and triglyceride were measured at 5 and 9 weeks,respectively。ResultsThere were no significant differences in body weight,systolic blood pressure,blood glucose,serum insulin,serum cholesterol and triglyceride before injection among four groups(allP>0.05).However,these parameters in high fat diet with STZ group were significantly increased after 4 weeksof injection(allP<0.05).In addition,these parameters showed no essentially change or only part of these parameters markedly increased in other three group after 4 weeks of injection。Conclusions Micemodelof type 2 DM can be successfully developed by high fat dietwith low dose STZ,which preferable mimicks the phenotype characteristics and natural development of humantype 2 DM.

Type-2 diabetesmellitus;Model,animal;C57BL/6J mice;High fat diet;Streptozotocin

R589.1,Q95-33

A

1671-7856(2010)03-0035-04

2009-11-12

姜骊(1981-)男,技术员,主要从事医学实验动物模型研究。

鱼达。E-mail:dayu46@hotmail.com