黄参多糖对小鼠骨骼肌自由基代谢及超微结构的影响

贾 磊,聂秀娟,方 梅,张 俊

(1.黄山学院 体育系,安徽 黄山 245041;2.甘肃农业大学 动物医学院,兰州 730070)

黄参多糖对小鼠骨骼肌自由基代谢及超微结构的影响

贾 磊1,聂秀娟1,方 梅2,张 俊1

(1.黄山学院 体育系,安徽 黄山 245041;2.甘肃农业大学 动物医学院,兰州 730070)

通过超氧化物歧化酶 (SOD)活性、丙二醛 (MDA)含量和超微结构的变化研究了黄参多糖 (SGP)对小鼠骨骼肌自由基代谢的影响。数据显示,游泳+SGP各剂量组安静时SOD活性是对照组的两倍左右,力竭运动后即刻组比对照和单纯运动的都高,且差异显著,24h后恢复也快,并有明显的量效关系,以剂量150-200mg·kg-1最佳。同时超微结构还表现出,对照组力竭运动后由于自由基的攻击出现了线粒体膜损坏,甚至有空泡化。还有肌丝松散、Z带弯曲等病理现象的产生。而灌服SGP的各组小鼠无这类现象,并有肌糖原积累、线粒体增多的证实。这全面显现出SGP对清除自由基,保护细胞膜,延缓疲劳,提高运动能力的作用。

黄参多糖;超氧化物歧化酶 (SOD);丙二醛 (MDA);骨骼肌;超微结构

黄参属伞形科迷果芹属的迷果芹 (Sphallerocarpus gracilis),多年生草本,根块状或圆锥形,可食。民间用全草入药,可以祛风除湿,主治风湿性关节痛等症[1]。因根部黄色,形似参,人们一直称其为黄参,常制成礼品馈赠亲友。现研究分析表明,黄参根部含有大量的糖分,约占总重的80%,非糖部分含有甾体及其甙、黄酮及其甙、α-细辛醚和有机酸,这些成分具有抗氧化、提高免疫、降血脂、保肝等多种生理功能[2]。为了研究黄参多糖对提高运动能力、延缓疲劳的作用,我们开展了此项研究。实验证实,黄参多糖(Sphallerocarpus gracilis polysaccharides,SGP)对运动时能量补充及激发糖代谢和能量代谢酶系活性有积极作用,并能对小鼠骨骼肌自由基代谢和超微结构产生深刻影响。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

取清洁级昆明种2月龄小白鼠180只 (购自甘肃省医学科学研究院实验动物中心),体重20±2g,雌雄各半。随机分为对照组、单纯游泳组和游泳+SGP组 (黄参多糖组,灌服用量分别为50、100、150、200 mg·kg-1)。对照组、单纯游泳组和不同剂量组中每组又有三小组,即力竭运动前处死安静组、力竭游泳后即刻组和力竭游泳后24h恢复组,每小组10只。

1.2 黄参多糖

从山丹祁连山北麓海拔2600m处采集野生黄参,取洗净晾干的肉质根2000g于60℃烘制4小时,取出置干燥器冷却,然后打成粗粉,加水煎提,用95%乙醇沉淀,用sevag法脱蛋白,醇析,丙酮洗涤,抽干,得灰褐色粗多糖SGP-1。将水煮的残渣用1.5%的氢氧化钠冷浸三次,过滤,用蒸馏水透析,用上法脱蛋白、醇析等处理得灰褐色粗碱溶多糖SGP-2。经测,SGP-1主要为葡萄糖,SGP-2含有鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸 (此方法已申请国家发明专利,申请号为2006101047142)。合并SGP-1和SGP-2为SGP,供实验用。

1.3 小鼠游泳实验

实验各组小鼠适应饲养2d后,游泳+SGP组每天按一定剂量SGP灌喂 (SGP按剂量用生理盐水稀释,以0.5ml/20g灌喂),对照组和单纯游泳组按等量生理盐水灌喂,连续3周。除对照组外,其它各组每天进行一次游泳锻炼,第一天30min,然后每天增加10min,从第六天开始,每天80min;放在塑料桶里,水深约40cm,水温20℃。第21天做力竭游泳 (包括对照组),标准是将小鼠放入水中开始记时,鼻部时露时没入水中立即捞出。力竭游泳后即刻组立即断头处死,恢复组在力竭游泳后24h处死。

1.4 SOD和MDA的测定

小鼠断头后取左腿骨骼肌,用4℃生理盐水洗去血污,每项测定称取0.1g湿组织,加入5ml 0.2mol/L的Tris-HCI缓冲液,p H7.3,研磨成匀浆,然后以10000r/min于4℃下离心机离心20min,取上清液,分别采用相关测试盒 (均购自南京建成生物工程研究所)进行测定。

1.5 骨骼肌电镜观察

取各组小鼠右腿骨骼肌5×5mm3组织块置于2%戌二醛固定液中,在4℃固定1-2h,然后用缓冲液反复洗涤2-3h(中间换液3次),再加入1%锇酸固定2h,经缓冲液冲洗3次,每次15min,各级酒精充分脱水,环氧树脂(Epon-812)包埋,超簿切片机切片,铀铅染色。透射电镜观察、照相。

1.6 数据处理

采用SPSS 11.0统计软件作统计学处理,数据以均数±标准差 (±s)表示,用t检验进行统计分析。

2 实验结果

2.1 黄参多糖 (SGP)对小鼠骨骼肌超氧化物歧化酶(SOD)的影响

表1 黄参多糖 (SGP)对小鼠骨骼肌SOD活性的影响 U/L

黄参多糖 (SGP)对小鼠骨骼肌超氧化物歧化酶(SOD)的影响见表1。对照组力竭运动后即刻骨骼肌SOD含量明显低于运动前安静时水平,差异显著,力竭后24h恢复组与即刻组相比仍有所下降,但无统计学意义。(此时只剩7只小鼠,3只在力竭游泳后死亡。)

单纯游泳组力竭运动前安静时SOD活性略高于对照组,说明通过锻炼,清除自由基酶的活力增强。但力竭后SOD活力显著降低,差异具有统计学意义 (P<0.05),且24h后几乎没有多少恢复,差异无统计学意义。

灌服SGP各剂量组小鼠骨骼肌SOD活性明显高于对照组,差异显著。力竭运动后即刻组、灌服 SGP各剂量组SOD活性均比单纯运动组高,同时有一定量效关系,以剂量150—200mg·kg-1效果较好。

力竭游泳后24h恢复组中,单纯游泳组小鼠骨骼肌中SOD恢复得很慢,同时显著低于运动前。而灌服SGP各组小鼠的骨骼肌中SOD恢复较快,都接近运动前水平,同时存在量效关系。

2.2 黄参多糖 (SGP)对小鼠骨骼肌中丙二醛 (MDA)含量的影响

表2 黄参多糖 (SGP)对小鼠骨骼肌 (MDA)含量的影响 nmol/L

黄参多糖 (SGP)对小鼠骨骼肌中丙二醛 (MDA)含量的影响见表2。对照组力竭后即刻MDA含量几乎是运动前的三倍,力竭后24hMDA含量仍在上升 (此时统计数字只有7只小鼠的,3只力竭运动后死亡)。

单纯游泳组力竭运动前MDA略低于对照组,说明通过锻炼过氧化产物能得到及时清除。但单纯游泳组力竭运动后即刻MDA含量显著升高 (P<0.01),24h后继续上升,且显著高于运动后即刻组 (P<0.01)。

灌服SGP各剂量组骨骼肌MDA含量均低于对照组,差异有的无统计学意义 (P>0.05),有的有统计学意义 (P<0.05)。存在一定的量效关系,以高剂量黄参多糖组150—200mg·kg-1对MDA抑制率较高。

力竭运动后24h,除单纯游泳组MDA含量显著高于对照组,也高于即刻组,差异具有显著性外,灌服SGP的各剂量组都低于运动后即刻组,接近力竭前安静组水平。

2.3 黄参多糖 (SGP)对小鼠骨骼肌超微结构的影响

SGP对小鼠骨骼肌超微结构的影响见下图。图1显示的是小鼠骨骼肌正常结构,肌纤维清晰可辨。肌纤维可分成许多肌节,每个肌节有明暗带相间的横纹。肌纤维的周围有一层结缔组织 (肌内膜),肌内膜中有肌浆网、线粒体和胶原纤维等。图2图3显示对照组小鼠力竭运动后,骨骼肌受到运动的强烈刺激,在氧自由基的作用下,骨骼肌超微结构受到破坏,出现了部分“肌丝松散”和“Z带弯曲”的现象。图4则表示对照组小鼠力竭游泳后线粒体膜损伤,甚至出现空泡化。这些结果与脂质过氧化产物增多是正相关的。

图1 对照组小鼠力竭游泳前骨骼肌纵切10000×,示正常结构

图2 对照组小鼠力竭游泳后即刻骨骼肌纵切10000×,示肌丝松散

图3 对照组小鼠力竭游泳后即刻骨骼肌纵切10000×,示Z带弯曲

图4 对照组小鼠力竭游泳后即刻骨骼肌纵切6600×,示线粒体有空泡化现象

图5 游泳+SGP(剂量150mg·kg-1)组小鼠力竭游泳后骨骼肌纵切15000×,示线粒体增多

图6 游泳+SGP(剂量150mg·kg-1)组小鼠力竭游泳后骨骼肌纵切10000×,示肌糖原增多

图5图6是灌服SGP高剂量组的小鼠骨骼肌超微结构。图中可见,骨骼肌超微结构不但没有出现“肌丝松散”和“Z带弯曲”的现象,而且明显表现出线粒体和肌糖原增多。这不仅直接从组织学给黄参多糖有助于小鼠肌糖原增多和供氧能力增强提供了科学依据,而且也全面显现出SGP在清除自由基、保护细胞膜、延缓疲劳和提高运动能力方面的作用。

3 讨论

在正常情况下,人体内自由基的产生和清除处于动态平衡状态,自由基的浓度很低,不会引起伤害。但是,当过度训练或受物理、化学因素刺激后,体内自由基就会增多,使自由基产生与清除之间的平衡状态被破坏,结果自由基的浓度超过了伤害的“阈值”,导致蛋白质、核酸、多糖和膜脂分子的氧化破坏,血液流变、呼吸等生理过程的改变和心脏、肺脏、肌肉、胃等器质性伤害[3]。特别是膜脂中的多不饱和脂肪酸双键最易受自由基的攻击发生过氧化作用,过氧化过程会产生新的自由基,从而促进膜脂的过氧化,膜的完整性受到破坏,使细胞内组分大量外漏,最后导致细胞伤害甚至死亡。

现代研究表明,运动疲劳的产生与氧自由基 (·OH)代谢有关,这是因为强运动刺激可引起氧自由基过剩。脂质过氧化是氧自由基损伤组织的重要方式之一,其损伤途径是氧自由基攻击细胞膜使膜脂过氧化形成过氧化脂质,再进一步分解产生丙二醛 (MDA)。因此,MDA可作为细胞被氧自由基伤害的定量指标,其含量越高,脂质过氧化程度也越高[4-8]。而超氧化物歧化酶 (SOD)能特异地、有效地清除氧自由基,阻止细胞膜的脂质过氧化,所以在研究运动对自由基代谢影响时常用这两种物质的消涨作为参考。

有研究表明,耐力训练能提高机体抗氧化酶活性[9-13],保护细胞的完整性及生理功能[14],这与本实验单纯游泳组与对照组的结果是一致的。但这种作用是有限的,采用灌服SGP+游泳,则可使小鼠骨骼肌中SOD活性明显升高,且MDA含量显著降低,并存在一定的量效关系,尤其是剂量在150—200mg·kg-1之间的效果较好,其SOD活性是对照组的2.3倍,MDA含量则降低了 7%。证明黄参多糖(SGP)能有效激发SOD酶基因的表达,使SOD活性随运动强度的增加而升高,并且提高了对膜脂过氧化产物MDA的清除能力,阻止了对细胞膜的进一步脂质过氧化,对延缓疲劳的发生和提高运动能力具有积极意义。

同时,本实验还从小鼠骨骼肌超微结构的变化上证实了黄参多糖 (SGP)对清除氧自由基、防止膜破坏方面的作用。当小鼠没有经过游泳锻炼而进行力竭运动时,骨骼肌中线粒体膜破坏严重,有的甚至出现空泡化 (图4),肌丝出现排列松散和Z带扭曲等一系列损伤 (图2和图3)。这是运动能力降低,疲劳产生,乃至无法恢复的机理所在。因为线粒体是生物氧化、产生能量的主要场所,三羧酸循环、呼吸链上的电子传递以及磷酸化都在线粒体膜上进行[15-17],其释放的高能磷酸键 (ATP)提供做功的能量,包括肌肉收缩[18-19]。一旦自由基过剩,首先遭攻击破坏的就是线粒体膜,从而导致供能不足,疲劳产生,运动能力下降,进一步则可引起肌纤维的损伤,从实验的图2、图3和图4中也得到证实。而灌服黄参多糖 (SGP)组的小鼠,尤其是剂量达到150mg·kg-1,随着SOD活性升高,清除氧自由基能力增强,细胞膜得到有效保护,肌纤维和线粒体都没有异化现象出现,相反却是线粒体增多,肌糖原积累增加 (图5、图6),大大提高了供能效果,增强了肌肉收缩做功的能力。这一切都表现出黄参多糖 (SGP)对影响骨骼肌氧自由基代谢、提高运动能力有着重要作用。

综上所述,实验证实黄参多糖 (SGP)能有效地激发SOD酶基因的表达,使SOD活性随运动强度的增加而升高,并且提高了对膜脂过氧化产物MDA的清除能力,阻止了对细胞膜的进一步脂质过氧化,对延缓疲劳的发生和提高运动能力具有积极意义。并且,实验还从小鼠骨骼肌超微结构的变化上证实了黄参多糖 (SGP)对清除氧自由基、防止膜破坏方面的作用。所以可以证实,黄参多糖 (SGP)对清除自由基、保护细胞膜、延缓疲劳和提高运动能力等方面均有着积极的作用,是一种很有潜能的运动营养补剂。

[1]郭本兆.青海经济植物志[M].西宁:青海人民出版社,1987:147.

[2]贾磊,赵曼容.山丹黄参对提高运动耐力和抗缺氧能力的研究[J].北京体育大学学报,2004,27(SI):110-111.

[3]贾磊,段玉虎.过度训练与自由基伤害[J].兰州大学学报,2001(Sl):230-233.

[4]Davies K J,Quintanilha A T,Brooks GA,et al.Free radical and tissue damage produced by exercise[J].Biophys Res Comm,1982,107:1198-1205.

[5]Vina J,Gomez Cabrera M C,Lloret A,et al.Free radicals in exhaustive physical exercise:mechanism of production and protection by antioxidants[J].IUBMB Life,2000,50(4):271-277.

[6]刘容娟.运动与自由基研究综述[J].湖北体育科技,2003,22(2):188-189.

[7]陈真.运动与自由基发展现状的研究[J].首都体育学院学报,2003,15(2):80-82.

[8]付克翠,陈菊平,陈元武.运动性疲劳概述[J].四川体育科学,2004(2):30-32.

[9]Power SK,Ji LL,Leeuwenburgh C.Exercise training-induced alterations in skeletal muscle antioxidant capacity:a brief review[J].Med Sci Sports Exerc,1991,31(7):987-997.

[10]Criswell D,Powers S,Dodd S,et al.High intensity training-induced changes in skeletal muscle antioxidant enzyme activity[J].Med Sci Sports Exerc,1993,25(10):1135-1140.

[11]Jenkins R R.Exercise,oxidative stress,and antioxidants:a review[J].Int J Sport Nutrition,1993,3(4):356-375.

[12]Ji L L.Exercise and oxidation stress:Role of the cellular antioxidant systems[J].Exercise and Sports Sciences Reviews,1995,23:135-166.

[13]李艳.运动、抗氧化剂与自由基代谢[J].安徽体育科技,2002,23(3):70-72.

[14]张全江,李秋霞,熊正英.耐力训练后再力竭运动对小鼠血液部分生化指标的影响[J],陕西师范大学学报:自然科学版,2004,32(1):98-101.

[15]郑国昌.细胞生物学[M].北京:高等教育出版社,1996:186-193.

[16]左伋.医学分子细胞生物学[M].上海:复旦大学出版社,2005:93-99.

[17]赵海军,徐晓阳,邓树勋.力竭运动对线粒体结构、功能的影响[J].成都体育学院学报,2000,26(6):63-66.

[18]Moreno S R.Regulation of oxidative phosphorylation in mitochondria by external free Ca2+concentration[J].Bio1 Chem,1980,260:4028.

[19]吴玲.运动与生物膜结构和功能关系的研究进展[J].中国运动医学杂志,1995,14(3):152-155.

Effect of Sphallerocarpus Gracilis Polysaccharides on Muscular Free Radical Metabolism and Ultrastructure in Mice

JIA Lei1,NIE Xiu-juan1,FANG Mei2,ZHANGJun1
(1.Department of Physical Education,Huangshan University,Huangshan 245041,China;2.College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

By the experiment of activity of SOD,the content of MDA and the changes of muscular ultrastructure,the effect of Sphallerocarpus gracilis polysacchorides(SGP)on muscular free radical metabolism in mice was investigated.The results showed the activity of SOD of all mice in swimming plus SGP groups was twice as much as the control group before swimming rest,and it was conspicuously higher than the control group and the swimming group after exhaustive exercise.The recovery was quick after 24 hours.Therefore,these results indicated SGP had significant close-effect in mice,especially 150-200mg·kg-1dose-effect was the best.Meanwhile,in muscular ultrastructure,the results showed mitochondrial membrane of mice in control group had been damaged after exhaustive exercise by attacked of free radical,especially the phenomenon of vacuolization had emerged.And the pathological phenomenon of looseness of myofilament and bend of Z band had appeared.But these phenomena had not appeared on all mice which were infused through mouth by SGP.Furthermore,the study showed SGP could increase the content of MGand mitochondria.So the study totally manifested the function of SGP on removing free radical,protecting membrane,delaying fatigue and improving exercise ability.

Sphallerocarpus gracilis polysacchorides(SGP);superoxide dismutase(SOD);malondialdehyde(MDA);skeletal muscle;ultrastructure

G804.7

:A

:1008-3596(2010)05-0058-05

2010-03-22

安徽省教育厅自然科学项目 (KJ2009B274Z);黄山学院引进人才启动项目资助 (2008xskq013)

贾 磊 (1971-),男,湖南岳阳人,博士,副教授,研究方向为运动分子生物学及运动生理学。